| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-25页 |
| 1.1 溶菌酶的简介 | 第13-17页 |
| 1.1.1 溶菌酶的性质和结构 | 第13-14页 |
| 1.1.2 溶菌酶的生物学功能 | 第14页 |
| 1.1.3 溶菌酶的分类 | 第14-17页 |
| 1.1.3.1 动物溶菌酶 | 第15-16页 |
| 1.1.3.2 植物溶菌酶 | 第16页 |
| 1.1.3.3 细菌和真菌溶菌酶 | 第16-17页 |
| 1.1.3.4 噬菌体溶菌酶 | 第17页 |
| 1.2 溶菌酶的应用 | 第17-18页 |
| 1.2.1 溶菌酶在食品中的应用 | 第17-18页 |
| 1.2.2 溶菌酶在养殖中的应用 | 第18页 |
| 1.2.3 溶菌酶在医疗中的应用 | 第18页 |
| 1.3 溶菌酶的分离纯化 | 第18-20页 |
| 1.3.1 结晶法 | 第18-19页 |
| 1.3.2 透析和超滤 | 第19页 |
| 1.3.3 亲和层析 | 第19页 |
| 1.3.4 离子交换层析 | 第19-20页 |
| 1.4 毕赤酵母的简述 | 第20-21页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统的应用 | 第20-21页 |
| 1.4.2 甲醇营养型毕赤酵母的优缺点 | 第21页 |
| 1.5 研究目的、内容和技术路线 | 第21-25页 |
| 1.5.1 研究目的和内容 | 第21-22页 |
| 1.5.2 技术路线 | 第22-25页 |
| 1.5.2.1 毕赤酵母基因工程菌的构建流程 | 第22-23页 |
| 1.5.2.2 海参溶菌酶在毕赤酵母中表达条件优化及纯化 | 第23-24页 |
| 1.5.2.3 重组海参溶菌酶在毕赤酵母中发酵及纯化 | 第24-25页 |
| 第二章 材料与方法 | 第25-49页 |
| 2.1 目的基因SjLys-HisN和SjLys-HisC构建、转化及菌株筛选 | 第25-36页 |
| 2.1.1 材料和仪器 | 第25-27页 |
| 2.1.1.1 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.1.2 主要试剂 | 第25页 |
| 2.1.1.3 培养基 | 第25-26页 |
| 2.1.1.4 常用溶液及缓冲液 | 第26-27页 |
| 2.1.1.5 主要仪器和设备 | 第27页 |
| 2.1.2 方法与步骤 | 第27-36页 |
| 2.1.2.1 引物的设计 | 第27-28页 |
| 2.1.2.2 目的基因SjLys-HisN和SjLys-HisC的扩增 | 第28-30页 |
| 2.1.2.3 目的基因与克隆载体的连接及转化到大肠杆菌DH5α | 第30-31页 |
| 2.1.2.4 重组克隆质粒的菌落PCR鉴定 | 第31-33页 |
| 2.1.2.5 重组克隆质粒的提取与双酶切 | 第33页 |
| 2.1.2.6 目的基因与表达载体的连接及转化到大肠杆菌DH5α | 第33-34页 |
| 2.1.2.7 pPIC9K-SjLys-HisN和pPIC9K-SjLys-HisC转化到毕赤酵母GS115及筛选 | 第34-36页 |
| 2.2 海参溶菌酶在毕赤酵母中的表达及分离纯化 | 第36-45页 |
| 2.2.1 材料和仪器 | 第36-39页 |
| 2.2.1.1 菌株和试剂 | 第36页 |
| 2.2.1.2 培养基 | 第36页 |
| 2.2.1.3 蛋白分离纯化常用溶液和缓冲溶液 | 第36-37页 |
| 2.2.1.4 SDS-PAGE电泳常用溶液和缓冲液 | 第37-38页 |
| 2.2.1.5 主要仪器 | 第38-39页 |
| 2.2.2 毕赤酵母基因工程菌表达海参溶菌酶条件优化 | 第39页 |
| 2.2.2.1 摇瓶培养 | 第39页 |
| 2.2.2.2 海参溶菌酶表达条件的优化 | 第39页 |
| 2.2.3 海参溶菌酶的纯化 | 第39-41页 |
| 2.2.3.1 超滤浓缩 | 第39-40页 |
| 2.2.3.2 透析 | 第40页 |
| 2.2.3.3 弱酸性阳离子交换层析 | 第40-41页 |
| 2.2.3.4 凝胶过滤层析 | 第41页 |
| 2.2.4 重组海参溶菌酶的纯化 | 第41-42页 |
| 2.2.4.1 超滤浓缩及缓冲液的置换 | 第41页 |
| 2.2.4.2 Ni2+亲和层析 | 第41-42页 |
| 2.2.5 SDS-PAGE及Western Blotting分析 | 第42-44页 |
| 2.2.5.1 TCA法沉淀蛋白 | 第42页 |
| 2.2.5.2 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第42-44页 |
| 2.2.5.3 表达产物的Western Blotting分析 | 第44页 |
| 2.2.6 蛋白含量测定 | 第44-45页 |
| 2.3 5L发酵罐发酵生产重组海参溶菌酶的研究 | 第45-47页 |
| 2.3.1 材料和仪器 | 第45-46页 |
| 2.3.1.1 菌株及试剂 | 第45页 |
| 2.3.1.2 培养基 | 第45-46页 |
| 2.3.1.3 主要仪器 | 第46页 |
| 2.3.2 5L发酵罐培养 | 第46-47页 |
| 2.3.2.1 发酵种子液培养 | 第46页 |
| 2.3.2.2 发酵罐的灭菌及电极标定 | 第46页 |
| 2.3.2.3 接种及初始培养 | 第46-47页 |
| 2.3.2.4 甘油流加阶段 | 第47页 |
| 2.3.2.5 甲醇诱导阶段 | 第47页 |
| 2.3.3 发酵生产重组海参溶菌酶的纯化 | 第47页 |
| 2.4 溶菌酶活性测定 | 第47-49页 |
| 2.4.1 菌株 | 第47-48页 |
| 2.4.2 比浊法 | 第48页 |
| 2.4.3 牛津杯法 | 第48-49页 |
| 第三章 结果与分析 | 第49-65页 |
| 3.1 SjLys-HisN和SjLys-HisC基因的扩增与重组质粒的构建 | 第49-52页 |
| 3.1.1 SjLys-HisN和SjLys-HisC基因的扩增 | 第49-50页 |
| 3.1.2 重组克隆质粒的菌落PCR鉴定 | 第50页 |
| 3.1.3 重组克隆质粒的双酶切 | 第50-52页 |
| 3.1.4 重组表达质粒的菌落PCR鉴定 | 第52页 |
| 3.2 重组表达质粒转化及高拷贝菌株筛选 | 第52-56页 |
| 3.2.1 重组表达质粒的转化 | 第52-54页 |
| 3.2.2 重组毕赤酵母高拷贝菌株筛选 | 第54页 |
| 3.2.3 毕赤酵母菌落PCR鉴定 | 第54-55页 |
| 3.2.4 重组海参溶菌酶的小规模培养 | 第55-56页 |
| 3.3 毕赤酵母基因工程菌表达海参溶菌酶条件优化及纯化 | 第56-61页 |
| 3.3.1 甲醇诱导浓度对发酵产酶的影响 | 第56-57页 |
| 3.3.2 培养基初始pH对发酵产酶的影响 | 第57页 |
| 3.3.3 发酵温度对发酵产酶的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.4 发酵时间对发酵产酶的影响 | 第58-59页 |
| 3.3.5 海参溶菌酶的纯化 | 第59-61页 |
| 3.4 毕赤酵母基因工程菌表达重组海参溶菌酶及纯化 | 第61-62页 |
| 3.5 发酵罐发酵产物纯化 | 第62-64页 |
| 3.6 抑菌活性分析 | 第64-65页 |
| 第四章 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附录A | 第70-71页 |
| 附录B | 第71页 |
