| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-22页 |
| 1.1 溶菌酶简介 | 第12-15页 |
| 1.1.1 溶菌酶的生物学性质 | 第12-13页 |
| 1.1.2 溶菌酶的分类 | 第13-15页 |
| 1.1.2.1 g型溶菌酶 | 第13页 |
| 1.1.2.2 c型溶菌酶 | 第13页 |
| 1.1.2.3 i型溶菌酶 | 第13-14页 |
| 1.1.2.4 细菌和真菌溶菌酶 | 第14页 |
| 1.1.2.5 植物溶菌酶 | 第14页 |
| 1.1.2.6 噬菌体溶菌酶 | 第14-15页 |
| 1.1.3 溶菌酶的应用 | 第15页 |
| 1.1.3.1 溶菌酶在食品上的应用 | 第15页 |
| 1.1.3.2 溶菌酶在畜牧业上的应用 | 第15页 |
| 1.1.3.3 溶菌酶在医药业的应用 | 第15页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统概述 | 第15-17页 |
| 1.2.1 宿主菌 | 第16页 |
| 1.2.2 表达载体 | 第16-17页 |
| 1.2.3 毕赤酵母表达系统的问题 | 第17页 |
| 1.3 基因优化概述 | 第17-18页 |
| 1.3.1 密码子偏好性 | 第17-18页 |
| 1.3.2 mRNA结构分析 | 第18页 |
| 1.4 发酵罐发酵技术 | 第18-19页 |
| 1.5 研究的主要内容、目标、意义及技术路线 | 第19-22页 |
| 1.5.1 研究的主要内容 | 第19页 |
| 1.5.2 研究的目标及意义 | 第19-20页 |
| 1.5.3 技术路线 | 第20-22页 |
| 1.5.3.1 毕赤酵母基因工程菌的构建及筛选 | 第20-21页 |
| 1.5.3.2 发酵罐发酵工艺流程 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-37页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第22-26页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 特异性引物 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 2.1.5 主要溶液及缓冲液 | 第24-25页 |
| 2.1.6 培养基 | 第25-26页 |
| 2.2 海参i-型溶菌酶基因优化及全基因合成 | 第26-27页 |
| 2.2.1 根据密码子偏好性优化 | 第26页 |
| 2.2.2 根据mRNA二级结构优化 | 第26页 |
| 2.2.3 全基因合成 | 第26-27页 |
| 2.3 构建表达质粒pPIC9K-opt-SjLys | 第27-28页 |
| 2.3.1 双酶切克隆质粒PMD18-T-opt-SjLys和表达载体pPIC9K | 第27-28页 |
| 2.3.2 构建重组表达质粒pPIC9K-opt-SjLys | 第28页 |
| 2.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备及转化 | 第28-29页 |
| 2.4.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 | 第28页 |
| 2.4.2 转化 | 第28-29页 |
| 2.5 提取表达质粒pPIC9K-opt-SjLys及测序验证 | 第29页 |
| 2.6 表达质粒pPIC9K-opt-SjLys的线性化 | 第29-30页 |
| 2.7 毕赤酵母GS115感受态细胞制备 | 第30页 |
| 2.8 电转化及毕赤酵母高拷贝转化子筛选 | 第30-31页 |
| 2.9 菌落PCR验证及摇瓶发酵 | 第31-32页 |
| 2.9.1 菌落PCR | 第31-32页 |
| 2.9.2 摇瓶发酵 | 第32页 |
| 2.10 表达产物SDS-PAGE检测 | 第32-33页 |
| 2.10.1 样品TCA沉淀处理 | 第32页 |
| 2.10.2 SDS-PAGE检测 | 第32-33页 |
| 2.11 抑菌实验 | 第33页 |
| 2.12 溶菌酶酶活测定 | 第33-35页 |
| 2.13 发酵罐发酵 | 第35-36页 |
| 2.13.1 种子液准备 | 第35页 |
| 2.13.2 罐体组装及灭菌 | 第35页 |
| 2.13.3 接种及初始培养 | 第35页 |
| 2.13.4 甘油流加阶段 | 第35页 |
| 2.13.5 甲醇诱导阶段 | 第35-36页 |
| 2.14 发酵液后续处理 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与分析 | 第37-56页 |
| 3.1 海参i-型溶菌酶基因优化 | 第37-44页 |
| 3.1.1 根据密码子偏好性优化基因 | 第37-41页 |
| 3.1.2 根据mRNA结构优化基因 | 第41-44页 |
| 3.2 构建重组表达质粒pPIC9K-opt-SjLys | 第44-47页 |
| 3.2.1 海参溶菌酶优化基因的全合成 | 第44-45页 |
| 3.2.2 克隆质粒pMD18-T-opt-SjLys的双酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 3.2.3 构建表达质粒pPIC9K-opt-SjLys并测序验证 | 第46-47页 |
| 3.3 重组毕赤酵母高拷贝转化子筛选 | 第47-49页 |
| 3.4 海参i-型溶菌酶的诱导表达及抑菌实验 | 第49-50页 |
| 3.4.1 诱导表达产物的SDS-PAGE分析 | 第49-50页 |
| 3.4.2 抑菌实验 | 第50页 |
| 3.5 发酵罐发酵生产海参i-型溶菌酶 | 第50-56页 |
| 3.5.1 工艺参数的控制对溶菌酶活性的影响 | 第50-54页 |
| 3.5.2 不同时期诱导产物的SDS-PAGE分析 | 第54-55页 |
| 3.5.3 抑菌实验 | 第55-56页 |
| 第四章 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-60页 |
| 致谢 | 第60页 |
