| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第1章 绪论 | 第13-25页 |
| 1.1 菊粉和菊粉酶 | 第13-14页 |
| 1.2 菊粉酶的来源和生产 | 第14-17页 |
| 1.3 低聚果糖 | 第17-18页 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第18-20页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统的组成 | 第18-19页 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统的优势 | 第19-20页 |
| 1.4.3 毕赤酵母表达系统在菊粉内切酶生产中的应用研究进展 | 第20页 |
| 1.5 菊粉内切酶的分子水平研究现状 | 第20-21页 |
| 1.6 本论文的研究内容和意义 | 第21-25页 |
| 第2章 菊粉内切酶基因INU2在毕赤酵母GS115中表达与研究 | 第25-49页 |
| 2.1 前言 | 第25页 |
| 2.2 材料与方法 | 第25-38页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.2.2 酶、药品和试剂盒 | 第25-26页 |
| 2.2.3 主要实验器材 | 第26-27页 |
| 2.2.4 培养基和试剂配制 | 第27-30页 |
| 2.2.5 试验方法 | 第30-38页 |
| 1. 无花果曲霉基因组的提取 | 第30页 |
| 2. 菊粉内切酶基因inu2的克隆 | 第30页 |
| 3. 重组质粒pPIC9K-INU2的构建 | 第30-32页 |
| 4. 重组质粒pPIC9K-INU2的验证 | 第32-33页 |
| 5. 重组质粒线性化 | 第33-34页 |
| 6. 毕赤酵母GS115感受态的制备及其电转 | 第34-35页 |
| 7. 转化子筛选 | 第35页 |
| 8. 阳性转化子的诱导表达 | 第35页 |
| 9. 菊粉酶酶活性的测定 | 第35-36页 |
| 10. 菊粉内切酶INU2的底物特异性检测 | 第36-37页 |
| 11. SDS-PAGE电泳检测 | 第37-38页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第38-48页 |
| 2.3.1 无花果曲霉(Aspergillus ficuum)基因组DNA的提取 | 第38页 |
| 2.3.2 菊粉内切酶基因的克隆 | 第38-39页 |
| 2.3.3 重组质粒pPIC9K-INU2的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.4 重组质粒pPIC9K-INU2的验证 | 第40-44页 |
| 2.3.5 转化子的菌落PCR验证 | 第44页 |
| 2.3.6 阳性转化子的诱导表达 | 第44-45页 |
| 2.3.7 重组表达酶INU2的底物特异性检测 | 第45-46页 |
| 2.3.8 重组表达酶INU2的SDS-PAGE电泳验证 | 第46页 |
| 2.3.9 重组INU2和INU3的分子结构分析 | 第46-48页 |
| 2.4 本章小结 | 第48-49页 |
| 第3章 多拷贝菊粉内切酶基因工程菌的筛选及其高密度发酵 | 第49-59页 |
| 3.1 前言 | 第49页 |
| 3.2 材料和方法 | 第49-54页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第49页 |
| 3.2.2 酶、药品和试剂盒 | 第49-50页 |
| 3.2.3 主要实验器材 | 第50页 |
| 3.2.4 培养基和试剂配制 | 第50-51页 |
| 3.2.5 试验方法 | 第51-54页 |
| 1. 筛选不同遗传霉素G418抗性的转化子 | 第51页 |
| 2. 实时荧光定量PCR确定转化子的inu2拷贝数 | 第51-53页 |
| 3. 多拷贝转化子的摇瓶发酵 | 第53页 |
| 4. 3L发酵罐分批补料培养 | 第53-54页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第54-58页 |
| 3.3.1 筛选G418抗性的转化子 | 第54-55页 |
| 3.3.2 实时荧光定量PCR确定转化子的INU2拷贝数 | 第55-56页 |
| 3.3.3 多拷贝转化子酶活力比较 | 第56-57页 |
| 3.3.4 转化子INU2-3的高密度发酵 | 第57-58页 |
| 3.4 本章小结 | 第58-59页 |
| 第4章 双启动子多拷贝菊粉内切酶基因工程菌的构建及其发酵菊粉酶液的分离纯化和特性研究 | 第59-81页 |
| 4.1 前言 | 第59页 |
| 4.2 材料和方法 | 第59-68页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第59页 |
| 4.2.2 酶、药品和试剂盒 | 第59-60页 |
| 4.2.3 主要实验器材 | 第60页 |
| 4.2.4 培养基和试剂配制 | 第60页 |
| 4.2.5 试验方法 | 第60-68页 |
| 1. 多拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建 | 第60-64页 |
| 2. 重组毕赤酵母INU2-3感受态的制备及电转化 | 第64页 |
| 3. 双启动子转化子的验证 | 第64页 |
| 4. 双启动子转化子中INU2拷贝数的确定 | 第64页 |
| 5. 双启动子转化子的高密度发酵 | 第64-65页 |
| 6. 重组酶INU2对底物菊粉的最适pH反应条件研究 | 第65页 |
| 7. 重组酶INU2对底物菊粉的最适温度反应条件研究 | 第65页 |
| 8. 酶解菊粉产物薄层层析 | 第65页 |
| 9. 粗酶液的蛋白盐析 | 第65-67页 |
| 10. 重组菊粉内切酶INU2保护剂的研究 | 第67-68页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第68-80页 |
| 4.3.1 多拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建 | 第68-70页 |
| 1. 重组质粒pGAPZαA-INU2的构建 | 第68页 |
| 2. 2拷贝重组质粒pGAPZαA-2INU2的构建 | 第68-69页 |
| 3. 3拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建 | 第69-70页 |
| 4.3.2 双启动子工程菌株的构建 | 第70页 |
| 4.3.3 双启动子转化子的验证 | 第70-71页 |
| 4.3.4 双启动子转化子中INU2拷贝数的确定 | 第71页 |
| 4.3.5 转化子INU2-A3-G2的高密度发酵 | 第71-72页 |
| 4.3.6 重组酶INU2对底物菊粉的最适pH反应条件研究 | 第72-73页 |
| 4.3.7 重组酶INU2对底物菊粉的最适温度反应条件研究 | 第73-74页 |
| 4.3.8 重组酶酶解菊粉产物的薄层层析 | 第74页 |
| 4.3.9 粗酶液的蛋白盐析 | 第74-76页 |
| 1. 硫酸铵盐析的最适pH选择 | 第75页 |
| 2. 盐析的最适硫酸铵饱和度选择 | 第75-76页 |
| 4.3.10 重组菊粉内切酶INU2保护剂的研究 | 第76-80页 |
| 1. 盐类(CaCl_2,MgSO_4,KCl,NaCl)对酶热稳定性影响 | 第76页 |
| 2. 糖类(葡萄糖,果糖,蔗糖,海藻糖)对酶热稳定性影响 | 第76-77页 |
| 3. 醇类(山梨醇,甘油,丙二醇,聚乙二醇,甘露醇)对酶热稳定影响 | 第77-78页 |
| 4. 复合保护剂配比的正交设计 | 第78-80页 |
| 4.4 本章小节 | 第80-81页 |
| 总结和创新点 | 第81-83页 |
| 1.1 论文总结 | 第81-82页 |
| 1.2 论文创新点 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-89页 |
| 在读期间发表的文章和奖励 | 第89-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 附件 | 第92页 |
