| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| 1.1 概述 | 第12页 |
| 1.2 唾液酸的国内外研究现状及进展 | 第12-16页 |
| 1.2.1 唾液酸的发现、命名和分类 | 第12-13页 |
| 1.2.2 自然界和人体中唾液酸的分布 | 第13-14页 |
| 1.2.3 唾液酸的理化性质和生理功能 | 第14-15页 |
| 1.2.4 唾液酸的应用前景 | 第15-16页 |
| 1.3 N-乙酰神经氨酸的制备与生产方法 | 第16-19页 |
| 1.3.1 自然物质提取法 | 第16页 |
| 1.3.2 水解聚唾液酸法 | 第16-17页 |
| 1.3.3 化学合成法 | 第17-18页 |
| 1.3.4 酶催化法 | 第18页 |
| 1.3.5 微生物发酵法 | 第18-19页 |
| 1.4 目前N-乙酰神经氨酸制备与生产中面临的问题 | 第19-20页 |
| 1.5 选题的立题依据、研究意义及主要研究内容 | 第20-24页 |
| 1.5.1 立题依据及研究意义 | 第20页 |
| 1.5.2 本论文要解决的主要问题 | 第20-22页 |
| 1.5.3 本论文的主要研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 Neu5Ac合成途径关键酶的表达及酶学性质表征 | 第24-42页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 材料与方法 | 第24-32页 |
| 2.2.1 基因、引物、菌种与质粒 | 第24-26页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第26-27页 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 | 第27页 |
| 2.2.4 分析方法 | 第27-29页 |
| 2.2.5 分子生物学操作方法 | 第29-31页 |
| 2.2.6 酶的诱导表达及粗酶液的制备 | 第31-32页 |
| 2.3 结果分析与讨论 | 第32-41页 |
| 2.3.1 猪肾脏和项圈藻中GlcNAc异构酶编码基因克隆及其表达载体构建 | 第32-33页 |
| 2.3.2 猪肾脏和项圈藻中GlcNAc异构酶在大肠杆菌中表达 | 第33-34页 |
| 2.3.3 猪肾脏和项圈藻中GlcNAc异构酶的酶学性质 | 第34-36页 |
| 2.3.4 大肠杆菌和空肠弯曲菌中Neu5Ac合成酶克隆及其表达载体构建 | 第36-37页 |
| 2.3.5 大肠杆菌和空肠弯曲菌中Neu5Ac合成酶在大肠杆菌中表达 | 第37页 |
| 2.3.6 大肠杆菌和空肠弯曲菌中Neu5Ac合成酶的酶学性质 | 第37-39页 |
| 2.3.7 分子伴侣对空肠弯曲菌Neu5Ac合成酶表达活性的影响 | 第39-41页 |
| 2.4 本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 宿主大肠杆菌改造及Neu5Ac合成途径构建 | 第42-56页 |
| 3.1 前言 | 第42页 |
| 3.2 材料与方法 | 第42-48页 |
| 3.2.1 基因、引物、菌种与质粒 | 第42-43页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第43页 |
| 3.2.3 培养基与培养条件 | 第43-44页 |
| 3.2.4 分析方法 | 第44-45页 |
| 3.2.5 分子生物学操作方法 | 第45-47页 |
| 3.2.6 共表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 3.2.7 生物转化合成Neu5Ac | 第48页 |
| 3.2.8 细胞比生长速率和Neu5Ac比合成速率的计算 | 第48页 |
| 3.3 结果分析与讨论 | 第48-55页 |
| 3.3.1 nanATEK基因簇的敲除 | 第48-49页 |
| 3.3.2 nanATEK基因簇敲除对阻断大肠杆菌中Neu5Ac分解途径的影响 | 第49-50页 |
| 3.3.3 Neu5Ac合成途径的构建 | 第50-51页 |
| 3.3.4 manXYZ基因簇的敲除 | 第51-52页 |
| 3.3.5 nagE基因的敲除 | 第52-53页 |
| 3.3.6 nagE和manXYZ的敲除改变Neu5Ac合成底物GlcNAc的跨膜转运方式 | 第53-54页 |
| 3.3.7 底物GlcNAc跨膜转运途径改造对Neu5Ac合成的影响 | 第54-55页 |
| 3.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第四章 建立PEP强化供给系统促进Neu5Ac合成 | 第56-70页 |
| 4.1 前言 | 第56页 |
| 4.2 材料与方法 | 第56-60页 |
| 4.2.1 基因、引物、质粒和菌种 | 第56-58页 |
| 4.2.2 试剂与仪器 | 第58页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第58页 |
| 4.2.4 分析方法 | 第58-59页 |
| 4.2.5 分子生物学操作方法 | 第59页 |
| 4.2.6 全细胞生物转化合成Neu5Ac | 第59页 |
| 4.2.7 细胞比生长速率和Neu5Ac比合成速率的计算 | 第59-60页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第60-68页 |
| 4.3.1 pck基因的克隆与表达载体的构建 | 第60页 |
| 4.3.2 ppsA基因的克隆与表达载体的构建 | 第60-61页 |
| 4.3.3 pck和ppsA基因共表达载体的构建 | 第61-62页 |
| 4.3.4 大肠杆菌DE3溶源化及T7启动子下游外源基因的诱导表达 | 第62-63页 |
| 4.3.5 pck和ppsA基因的单独过表达促进Neu5Ac合成 | 第63页 |
| 4.3.6 pck和ppsA基因的共同过表达促进Neu5Ac合成 | 第63-67页 |
| 4.3.7 不同PEP供给系统中Neu5Ac合成途径中相关基因转录水平的变化 | 第67页 |
| 4.3.8 重组大肠杆菌的验证 | 第67-68页 |
| 4.4 本章小结 | 第68-70页 |
| 第五章 Neu5Ac生物转化合成过程优化 | 第70-81页 |
| 5.1 前言 | 第70页 |
| 5.2 材料与方法 | 第70-71页 |
| 5.2.1 菌种 | 第70页 |
| 5.2.2 试剂与仪器 | 第70页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第70-71页 |
| 5.2.4 分析方法 | 第71页 |
| 5.2.5 全细胞生物转化合成Neu5Ac | 第71页 |
| 5.2.6 细胞比生长速率和Neu5Ac比合成速率的计算 | 第71页 |
| 5.3 结果分析与讨论 | 第71-79页 |
| 5.3.1 双阶段生物转化合成Neu5Ac过程 | 第71-72页 |
| 5.3.2 氮源对生物转化合成Neu5Ac的影响 | 第72-75页 |
| 5.3.3 碳源对生物转化合成Neu5Ac的影响 | 第75-76页 |
| 5.3.4 表面活性剂对生物转化合成Neu5Ac的影响 | 第76-77页 |
| 5.3.5 发酵罐中的生物转化合成Neu5Ac过程 | 第77-78页 |
| 5.3.6 本论文生物转化合成Neu5Ac过程与其他Neu5Ac合成过程的比较分析 | 第78-79页 |
| 5.4 本章小结 | 第79-81页 |
| 主要结论与展望 | 第81-83页 |
| 主要结论 | 第81-82页 |
| 展望 | 第82-83页 |
| 论文主要创新点 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-95页 |
| 附录 作者在攻读博士学位期间发表论文 | 第95页 |
