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黑曲霉高产柠檬酸机制及代谢调控研究

摘要第3-5页
Abstract第5-6页
第一章 绪论第10-20页
    1.1 概述第10-11页
    1.2 黑曲霉发酵生产柠檬酸的条件第11-12页
    1.3 黑曲霉柠檬酸发酵的途径及生化机制研究第12-14页
    1.4 菌种改造以提高柠檬酸产量第14-16页
        1.4.1 对糖酵解和TCA循环的改造第14-15页
        1.4.2 抑制因子及副产物的去除第15页
        1.4.3 回补途径的加强第15页
        1.4.4 侧呼吸链的加强第15页
        1.4.5 乙酰-CoA的调节第15-16页
        1.4.6 碳源利用的加强第16页
    1.5 黑曲霉作为工业生产菌的优势及代谢改造方法第16-18页
    1.6 立题依据及研究意义第18页
    1.7 本论文的主要研究内容第18-20页
第二章 黑曲霉遗传转化系统的建立第20-36页
    2.1 前言第20-21页
    2.2 实验材料和方法第21-26页
        2.2.1 菌株和质粒第21页
        2.2.2 培养基和培养条件第21页
        2.2.3 试剂和仪器第21-22页
        2.2.4 黑曲霉和构巢曲霉基因组的提取第22页
        2.2.5 表达载体的构建第22-25页
        2.2.6 黑曲霉H915-1 原生质体的制备第25页
        2.2.7 原生质体再生第25页
        2.2.8 PEG介导法转化黑曲霉原生质体第25页
        2.2.9 胞外代谢物的定量第25页
        2.2.10 总糖和还原糖的测定第25-26页
    2.3 结果与讨论第26-34页
        2.3.1 细胞壁酶解液的优化第26-27页
        2.3.2 酶解作用条件的优化第27-28页
        2.3.3 菌体预培养条件的优化第28-31页
        2.3.4 外源基因的整合表达第31-32页
        2.3.5 敲除oah基因以消除草酸的形成第32-34页
    2.4 本章小结第34-36页
第三章 黑曲霉高产柠檬酸的比较基因组学分析第36-56页
    3.1 前言第36-37页
    3.2 实验材料和方法第37-40页
        3.2.1 菌株第37页
        3.2.2 试剂和仪器第37页
        3.2.3 培养基及缓冲液第37页
        3.2.4 摇瓶和发酵罐培养条件第37-38页
        3.2.5 胞外代谢物的定量第38页
        3.2.6 等离子诱变及高通量筛选柠檬酸低产菌第38页
        3.2.7 基因组提取第38页
        3.2.8 二代测序与组装第38页
        3.2.9 三代测序与组装第38-39页
        3.2.10 基因组注释第39页
        3.2.11 基因家族分析第39页
        3.2.12 重复序列分析第39页
        3.2.13 SNP、INDEL和SV分析第39-40页
    3.3 结果与讨论第40-54页
        3.3.1 等离子诱变和高通量筛选获得黑曲霉柠檬酸低产菌株第40-44页
        3.3.2 黑曲霉基因组组装与注释信息第44-46页
        3.3.3 基因组比较分析第46-54页
    3.4 本章小结第54-56页
第四章 转录组学解析黑曲霉高产柠檬酸机制第56-71页
    4.1 前言第56页
    4.2 实验材料和方法第56-59页
        4.2.1 菌株第56页
        4.2.2 试剂和仪器第56-57页
        4.2.3 培养基及缓冲液第57页
        4.2.4 培养条件第57页
        4.2.5 胞外代谢物的定量第57页
        4.2.6 生物量的测定第57页
        4.2.7 RNA的提取第57页
        4.2.8 RNA测序第57-58页
        4.2.9 测序数据的分析处理第58页
        4.2.10 总RNA的逆转录第58页
        4.2.11 实时荧光定量PCR(q PCR)第58-59页
    4.3 实验结果第59-70页
        4.3.1 转录组学结果分析第59-61页
        4.3.2 中心代谢通路(糖酵解途径、TCA循环、r TCA循环和GABA通路)的调节第61-63页
        4.3.3 无效循环与侧呼吸链共同作用平衡胞内能量第63-65页
        4.3.4 杂酸生成相关基因的调节第65页
        4.3.5 转运蛋白基因表达的调控第65-66页
        4.3.6 细胞壁合成相关基因的调控第66-70页
    4.4 本章小结第70-71页
第五章 利用低pH诱导的启动子动态调控黑曲霉的代谢通路第71-86页
    5.1 前言第71-72页
    5.2 材料与方法第72-77页
        5.2.1 菌株和质粒第72页
        5.2.2 培养基、试剂配方和培养条件第72-73页
        5.2.3 试剂和仪器第73页
        5.2.4 启动子的筛选第73-74页
        5.2.5 黑曲霉基因组、黑曲霉及土曲霉总RNA的提取第74页
        5.2.6 总RNA的逆转录第74页
        5.2.7 表达载体的构建第74-76页
        5.2.8 sGFP转化子的荧光显微镜检测第76页
        5.2.9 总蛋白的提取第76页
        5.2.10 蛋白定量第76页
        5.2.11 sGFP荧光强度检测第76-77页
        5.2.12 衣康酸发酵第77页
        5.2.13 有机酸的HPLC检测第77页
        5.2.14 qPCR第77页
        5.2.15 DNA pull-down第77页
    5.3 结果与讨论第77-85页
        5.3.1 基于转录组学数据筛选低pH诱导基因第77-78页
        5.3.2 sGFP在gas启动子下的诱导表达第78-80页
        5.3.3 利用Pgas动态调控黑曲霉合成衣康酸第80-82页
        5.3.4 Pgas诱导条件的分析第82-83页
        5.3.5 Pgas调控因子的确定第83-85页
    5.4 本章小结第85-86页
第六章 调控黑曲霉葡萄糖转运系统增强柠檬酸的合成第86-95页
    6.1 前言第86-87页
    6.2 材料与方法第87-89页
        6.2.1 菌株和质粒第87页
        6.2.2 培养基、试剂配方和培养条件第87页
        6.2.3 试剂和仪器第87页
        6.2.4 黑曲霉基因组、总RNA的提取第87页
        6.2.5 总RNA的逆转录第87-88页
        6.2.6 进化树分析第88页
        6.2.7 跨膜区域预测第88页
        6.2.8 表达框的构建第88页
        6.2.9 总糖、还原糖及未分解还原糖的测定第88-89页
        6.2.10 胞外代谢物的定量第89页
    6.3 结果与讨论第89-94页
        6.3.1 柠檬酸发酵糖耗速率的变化第89页
        6.3.2 葡萄糖转运蛋白的进化树分析及跨膜预测第89-91页
        6.3.3 黑曲霉HGT1转化子的柠檬酸发酵第91-93页
        6.3.4 HGT1对黑曲霉在葡萄糖限制性培养基上生长的影响第93-94页
    6.4 本章小结第94-95页
主要结论与展望第95-98页
论文创新点第98-99页
致谢第99-100页
参考文献第100-108页
附录I 作者在攻读博士学位期间发表的论文第108-109页
附录II 柠檬酸发酵过程中心代谢通路(糖酵解途径、TCA循环和GABA通路)和能量调节第109-115页
附录III 细胞壁合成相关基因在柠檬酸发酵过程中的变化第115-123页

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