| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 概述 | 第10-11页 |
| 1.2 黑曲霉发酵生产柠檬酸的条件 | 第11-12页 |
| 1.3 黑曲霉柠檬酸发酵的途径及生化机制研究 | 第12-14页 |
| 1.4 菌种改造以提高柠檬酸产量 | 第14-16页 |
| 1.4.1 对糖酵解和TCA循环的改造 | 第14-15页 |
| 1.4.2 抑制因子及副产物的去除 | 第15页 |
| 1.4.3 回补途径的加强 | 第15页 |
| 1.4.4 侧呼吸链的加强 | 第15页 |
| 1.4.5 乙酰-CoA的调节 | 第15-16页 |
| 1.4.6 碳源利用的加强 | 第16页 |
| 1.5 黑曲霉作为工业生产菌的优势及代谢改造方法 | 第16-18页 |
| 1.6 立题依据及研究意义 | 第18页 |
| 1.7 本论文的主要研究内容 | 第18-20页 |
| 第二章 黑曲霉遗传转化系统的建立 | 第20-36页 |
| 2.1 前言 | 第20-21页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第21-26页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第21页 |
| 2.2.2 培养基和培养条件 | 第21页 |
| 2.2.3 试剂和仪器 | 第21-22页 |
| 2.2.4 黑曲霉和构巢曲霉基因组的提取 | 第22页 |
| 2.2.5 表达载体的构建 | 第22-25页 |
| 2.2.6 黑曲霉H915-1 原生质体的制备 | 第25页 |
| 2.2.7 原生质体再生 | 第25页 |
| 2.2.8 PEG介导法转化黑曲霉原生质体 | 第25页 |
| 2.2.9 胞外代谢物的定量 | 第25页 |
| 2.2.10 总糖和还原糖的测定 | 第25-26页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第26-34页 |
| 2.3.1 细胞壁酶解液的优化 | 第26-27页 |
| 2.3.2 酶解作用条件的优化 | 第27-28页 |
| 2.3.3 菌体预培养条件的优化 | 第28-31页 |
| 2.3.4 外源基因的整合表达 | 第31-32页 |
| 2.3.5 敲除oah基因以消除草酸的形成 | 第32-34页 |
| 2.4 本章小结 | 第34-36页 |
| 第三章 黑曲霉高产柠檬酸的比较基因组学分析 | 第36-56页 |
| 3.1 前言 | 第36-37页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第37-40页 |
| 3.2.1 菌株 | 第37页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第37页 |
| 3.2.3 培养基及缓冲液 | 第37页 |
| 3.2.4 摇瓶和发酵罐培养条件 | 第37-38页 |
| 3.2.5 胞外代谢物的定量 | 第38页 |
| 3.2.6 等离子诱变及高通量筛选柠檬酸低产菌 | 第38页 |
| 3.2.7 基因组提取 | 第38页 |
| 3.2.8 二代测序与组装 | 第38页 |
| 3.2.9 三代测序与组装 | 第38-39页 |
| 3.2.10 基因组注释 | 第39页 |
| 3.2.11 基因家族分析 | 第39页 |
| 3.2.12 重复序列分析 | 第39页 |
| 3.2.13 SNP、INDEL和SV分析 | 第39-40页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第40-54页 |
| 3.3.1 等离子诱变和高通量筛选获得黑曲霉柠檬酸低产菌株 | 第40-44页 |
| 3.3.2 黑曲霉基因组组装与注释信息 | 第44-46页 |
| 3.3.3 基因组比较分析 | 第46-54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-56页 |
| 第四章 转录组学解析黑曲霉高产柠檬酸机制 | 第56-71页 |
| 4.1 前言 | 第56页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第56-59页 |
| 4.2.1 菌株 | 第56页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第56-57页 |
| 4.2.3 培养基及缓冲液 | 第57页 |
| 4.2.4 培养条件 | 第57页 |
| 4.2.5 胞外代谢物的定量 | 第57页 |
| 4.2.6 生物量的测定 | 第57页 |
| 4.2.7 RNA的提取 | 第57页 |
| 4.2.8 RNA测序 | 第57-58页 |
| 4.2.9 测序数据的分析处理 | 第58页 |
| 4.2.10 总RNA的逆转录 | 第58页 |
| 4.2.11 实时荧光定量PCR（q PCR） | 第58-59页 |
| 4.3 实验结果 | 第59-70页 |
| 4.3.1 转录组学结果分析 | 第59-61页 |
| 4.3.2 中心代谢通路（糖酵解途径、TCA循环、r TCA循环和GABA通路）的调节 | 第61-63页 |
| 4.3.3 无效循环与侧呼吸链共同作用平衡胞内能量 | 第63-65页 |
| 4.3.4 杂酸生成相关基因的调节 | 第65页 |
| 4.3.5 转运蛋白基因表达的调控 | 第65-66页 |
| 4.3.6 细胞壁合成相关基因的调控 | 第66-70页 |
| 4.4 本章小结 | 第70-71页 |
| 第五章 利用低pH诱导的启动子动态调控黑曲霉的代谢通路 | 第71-86页 |
| 5.1 前言 | 第71-72页 |
| 5.2 材料与方法 | 第72-77页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第72页 |
| 5.2.2 培养基、试剂配方和培养条件 | 第72-73页 |
| 5.2.3 试剂和仪器 | 第73页 |
| 5.2.4 启动子的筛选 | 第73-74页 |
| 5.2.5 黑曲霉基因组、黑曲霉及土曲霉总RNA的提取 | 第74页 |
| 5.2.6 总RNA的逆转录 | 第74页 |
| 5.2.7 表达载体的构建 | 第74-76页 |
| 5.2.8 sGFP转化子的荧光显微镜检测 | 第76页 |
| 5.2.9 总蛋白的提取 | 第76页 |
| 5.2.10 蛋白定量 | 第76页 |
| 5.2.11 sGFP荧光强度检测 | 第76-77页 |
| 5.2.12 衣康酸发酵 | 第77页 |
| 5.2.13 有机酸的HPLC检测 | 第77页 |
| 5.2.14 qPCR | 第77页 |
| 5.2.15 DNA pull-down | 第77页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第77-85页 |
| 5.3.1 基于转录组学数据筛选低pH诱导基因 | 第77-78页 |
| 5.3.2 sGFP在gas启动子下的诱导表达 | 第78-80页 |
| 5.3.3 利用Pgas动态调控黑曲霉合成衣康酸 | 第80-82页 |
| 5.3.4 Pgas诱导条件的分析 | 第82-83页 |
| 5.3.5 Pgas调控因子的确定 | 第83-85页 |
| 5.4 本章小结 | 第85-86页 |
| 第六章 调控黑曲霉葡萄糖转运系统增强柠檬酸的合成 | 第86-95页 |
| 6.1 前言 | 第86-87页 |
| 6.2 材料与方法 | 第87-89页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第87页 |
| 6.2.2 培养基、试剂配方和培养条件 | 第87页 |
| 6.2.3 试剂和仪器 | 第87页 |
| 6.2.4 黑曲霉基因组、总RNA的提取 | 第87页 |
| 6.2.5 总RNA的逆转录 | 第87-88页 |
| 6.2.6 进化树分析 | 第88页 |
| 6.2.7 跨膜区域预测 | 第88页 |
| 6.2.8 表达框的构建 | 第88页 |
| 6.2.9 总糖、还原糖及未分解还原糖的测定 | 第88-89页 |
| 6.2.10 胞外代谢物的定量 | 第89页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第89-94页 |
| 6.3.1 柠檬酸发酵糖耗速率的变化 | 第89页 |
| 6.3.2 葡萄糖转运蛋白的进化树分析及跨膜预测 | 第89-91页 |
| 6.3.3 黑曲霉HGT1转化子的柠檬酸发酵 | 第91-93页 |
| 6.3.4 HGT1对黑曲霉在葡萄糖限制性培养基上生长的影响 | 第93-94页 |
| 6.4 本章小结 | 第94-95页 |
| 主要结论与展望 | 第95-98页 |
| 论文创新点 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-108页 |
| 附录I 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第108-109页 |
| 附录II 柠檬酸发酵过程中心代谢通路（糖酵解途径、TCA循环和GABA通路）和能量调节 | 第109-115页 |
| 附录III 细胞壁合成相关基因在柠檬酸发酵过程中的变化 | 第115-123页 |
