| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略语 | 第7-8页 |
| 目录 | 第8-13页 |
| 第1章 前言 | 第13-26页 |
| 1.1 单域重链抗体 | 第13-16页 |
| 1.1.1 单域重链抗体的结构 | 第13-14页 |
| 1.1.2 单域重链抗体的理化特征 | 第14-15页 |
| 1.1.3 单域重链抗体的应用价值 | 第15-16页 |
| 1.2 碱性磷酸酶 | 第16-19页 |
| 1.2.1 大肠杆菌碱性磷酸酶的结构 | 第17-18页 |
| 1.2.2 大肠杆菌碱性磷酸酶的催化作用机制 | 第18页 |
| 1.2.3 碱性磷酸酶的应用价值 | 第18-19页 |
| 1.3 包涵体的形成 | 第19-21页 |
| 1.3.1 包涵体的性质 | 第19-20页 |
| 1.3.2 包涵体形成原因 | 第20页 |
| 1.3.3 包涵体解决策略 | 第20-21页 |
| 1.4 位点特异性重组技术 | 第21-24页 |
| 1.4.1 FLP/FRT 重组系统 | 第21-22页 |
| 1.4.2 Cre/LoxP 重组系统 | 第22-24页 |
| 1.5 主要研究内容及意义 | 第24-26页 |
| 1.5.1 主要研究内容 | 第24页 |
| 1.5.2 研究意义 | 第24-26页 |
| 第2章 单域重链抗体和碱性磷酸酶的克隆和表达 | 第26-45页 |
| 2.1 材料、仪器和试剂 | 第26-28页 |
| 2.1.1 材料 | 第26页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第26-27页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第27页 |
| 2.1.4 培养基和溶液 | 第27-28页 |
| 2.2 方法和步骤 | 第28-33页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第28页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第28页 |
| 2.2.3 单域重链抗体及碱性磷酸酶的 PCR 扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.4 表达载体 pET25b(+)，pET22b(+)质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.5 表达载体 pET25b(+)，pET22b(+)和目的片段的双酶切 | 第30页 |
| 2.2.6 表达载体和目的片段的连接 | 第30-31页 |
| 2.2.7 连接产物的转化 | 第31页 |
| 2.2.8 阳性克隆子的鉴定 | 第31页 |
| 2.2.9 表达宿主菌感受态的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.10 重组质粒转化表达宿主菌 | 第32页 |
| 2.2.11 重组蛋白的诱导表达 | 第32页 |
| 2.2.12 SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达 | 第32-33页 |
| 2.3 结果和分析 | 第33-43页 |
| 2.3.1 单域重链抗体及碱性磷酸酶 PCR 扩增结果 | 第33-34页 |
| 2.3.2 表达载体的构建 | 第34-37页 |
| 2.3.3 蛋白诱导表达的可溶性分析 | 第37-43页 |
| 2.4 讨论和小结 | 第43-45页 |
| 2.4.1 讨论 | 第43-44页 |
| 2.4.2 小结 | 第44-45页 |
| 第3章 单域重链抗体和碱性磷酸酶外部表达条件的优化和纯化 | 第45-61页 |
| 3.1 仪器和试剂 | 第45-46页 |
| 3.1.1 主要仪器 | 第45页 |
| 3.1.2 培养基和试剂 | 第45-46页 |
| 3.2 方法 | 第46-48页 |
| 3.2.1 温度对蛋白表达条件的影响 | 第46页 |
| 3.2.2 装液量对蛋白表达条件的影响 | 第46页 |
| 3.2.3 FPLC 纯化蛋白 | 第46-47页 |
| 3.2.4 目的蛋白的纯化 | 第47-48页 |
| 3.2.5 BCA 法检测蛋白浓度 | 第48页 |
| 3.3 结果分析 | 第48-59页 |
| 3.3.1 温度对蛋白表达条件的影响 | 第48-51页 |
| 3.3.2 装液量（溶氧）对蛋白表达条件的影响 | 第51-55页 |
| 3.3.3 目的蛋白的纯化 | 第55-58页 |
| 3.3.4 目的蛋白浓度的检测 | 第58-59页 |
| 3.4 讨论和小结 | 第59-61页 |
| 3.4.1 讨论 | 第59-60页 |
| 3.4.2 小结 | 第60-61页 |
| 第4章 单域重链抗体亲和力和碱性磷酸酶酶活力的分析 | 第61-71页 |
| 4.1 仪器和试剂 | 第61-62页 |
| 4.1.1 主要仪器 | 第61页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第61页 |
| 4.1.3 主要溶液 | 第61-62页 |
| 4.2 方法 | 第62-64页 |
| 4.2.1 单域重链抗体 T9 和 T10 对小鼠 Ig G Fc 段结合力分析 | 第62页 |
| 4.2.2 重组蛋白 T9 (10)-AP 对小鼠 Ig G Fc 段结合活性分析（直接ELISA） | 第62-63页 |
| 4.2.3 重组蛋白 T9 (10)-AP 对小鼠 Ig G Fc 段结合力分析（间接 ELISA） | 第63-64页 |
| 4.2.4 重组蛋白 T9 (10)-AP 及碱性磷酸酶活性分析 | 第64页 |
| 4.3 结果分析 | 第64-69页 |
| 4.3.1 单域重链抗体 T9 和 T10 对小鼠 Ig G Fc 段结合力分析 | 第64-65页 |
| 4.3.2 重组蛋白 T9 (10)-AP 对小鼠 Ig G Fc 段结合活性分析（直接ELISA） | 第65-66页 |
| 4.3.3 重组蛋白 T9 (10)-AP 对小鼠 Ig G Fc 段结合力分析（间接 ELISA）55 | 第66-67页 |
| 4.3.4 重组蛋白 T9 (10)-AP 及碱性磷酸酶活性分析 | 第67-69页 |
| 4.4 讨论和小结 | 第69-71页 |
| 4.4.1 讨论 | 第69页 |
| 4.4.2 小结 | 第69-71页 |
| 第5章 大肠杆菌遗传操作系统的改造 | 第71-91页 |
| 5.1 材料、仪器和试剂 | 第71-72页 |
| 5.1.1 材料 | 第71-72页 |
| 5.1.2 主要仪器 | 第72页 |
| 5.1.3 主要试剂 | 第72页 |
| 5.2 方法 | 第72-82页 |
| 5.2.1 引物设计 | 第72-74页 |
| 5.2.2 质粒 pULM，pSLM 和 pSLM-glk 的构建 | 第74-77页 |
| 5.2.3 外源线性打靶 DNA 片段的制备 | 第77-78页 |
| 5.2.4 Red 基因的诱导表达及电转感受态细胞的制备 | 第78页 |
| 5.2.5 电击转化 | 第78-79页 |
| 5.2.6 基因敲除菌株鉴定 | 第79页 |
| 5.2.7 重组酶 Cre 的表达质粒 pSB1S-Cre 的构建 | 第79-82页 |
| 5.2.8 卡那霉素抗性基因的去除 | 第82页 |
| 5.3 结果分析 | 第82-88页 |
| 5.3.1 质粒 pULM, pSLM 和 pSLM-glk 的构建 | 第82-84页 |
| 5.3.2 外源线性打靶 DNA 片段的制备 | 第84页 |
| 5.3.3 pgi 基因敲除菌种及 glk 基因整合菌种的 PCR 鉴定 | 第84-87页 |
| 5.3.4 重组酶 Cre 的表达质粒 pSB1S-Cre 的构建 | 第87页 |
| 5.3.5 卡那霉素抗性基因的去除 | 第87-88页 |
| 5.4 讨论和小结 | 第88-91页 |
| 5.4.1 讨论 | 第88-90页 |
| 5.4.2 小结 | 第90-91页 |
| 第6章 结论和展望 | 第91-92页 |
| 6.1 结论 | 第91页 |
| 6.2 展望 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-100页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第100页 |
| 个人简历 | 第100页 |
