| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第17-27页 |
| 1.1 聚羟基脂肪酸酯(PHA) | 第17-22页 |
| 1.1.1 PHA背景介绍 | 第17-18页 |
| 1.1.2 PHA的结构 | 第18-19页 |
| 1.1.3 PHA的分类 | 第19页 |
| 1.1.4 PHA的合成 | 第19-21页 |
| 1.1.5 PHA的降解 | 第21页 |
| 1.1.6 PHA的性质及应用 | 第21-22页 |
| 1.2 聚3-羟基丙酸酯(P3HP) | 第22-24页 |
| 1.3 PHA合成酶(PhaC) | 第24-25页 |
| 1.4 PHA的提取和测定 | 第25页 |
| 1.5 肺炎克雷伯氏菌 | 第25页 |
| 1.6 本课题研究意义 | 第25-27页 |
| 第二章 丙醛脱氢酶(PduP)途径生产P3HP | 第27-49页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-29页 |
| 2.2.1 菌株及载体 | 第27-28页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第28页 |
| 2.2.3 培养基及培养条件 | 第28-29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-40页 |
| 2.3.1 菌种活化 | 第29页 |
| 2.3.2 菌种保藏 | 第29页 |
| 2.3.3 分子生物学基本实验操作 | 第29-34页 |
| 2.3.4 工程菌摇瓶发酵及取样 | 第34-35页 |
| 2.3.5 气相色谱(GC)测定3-羟基丙酸甲酯 | 第35-36页 |
| 2.3.6 气质联用色谱(GC-MS)对产物的检测 | 第36页 |
| 2.3.7 强启动子表达载体pET-tac的构建 | 第36-37页 |
| 2.3.8 丙醛脱氢酶基因pduP的克隆及表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.3.9 PHA合成酶基因phaC的克隆及表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.10 重组载体pET-tac-pduP-phaC及工程菌的构建 | 第39页 |
| 2.3.11 重组工程菌K.p(pET-tac-pduP-phaC)的发酵 | 第39-40页 |
| 2.3.12 产物P3HP的检测 | 第40页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第40-48页 |
| 2.4.1 表达载体pET-tac构建结果 | 第40-41页 |
| 2.4.2 pduP的克隆及表达载体构建结果 | 第41-42页 |
| 2.4.3 phaC的克隆及表达载体构建结果 | 第42-44页 |
| 2.4.4 重组载体pET-tac-pduP-phaC及工程菌构建结果 | 第44-45页 |
| 2.4.5 重组工程菌K.p(pET-tac-pduP-phaC)摇瓶发酵结果 | 第45-46页 |
| 2.4.6 重组工程菌K.(pET-tac-pduP-phaC)摇瓶发酵产物检测 | 第46-47页 |
| 2.4.7 气相色谱-质谱联用(GC-MS)对甲酯化样品的分析鉴定 | 第47-48页 |
| 2.5 本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 丙醛脱氢酶(PduP)途径的优化 | 第49-69页 |
| 3.1 引言 | 第49-50页 |
| 3.2 实验材料 | 第50页 |
| 3.2.1 菌株、载体及引物 | 第50页 |
| 3.2.2 培养基及试剂 | 第50页 |
| 3.3 实验方法 | 第50-54页 |
| 3.3.1 分子生物学基本实验操作 | 第50-52页 |
| 3.3.2 双启动子表达载体pET-tac-pduP-tac-phaC的构建 | 第52页 |
| 3.3.3 重组菌K.p(pET-tac-pduP-tac-phaC)的构建 | 第52页 |
| 3.3.4 重组菌K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)的摇瓶发酵 | 第52页 |
| 3.3.5 产物P3HP的检测 | 第52页 |
| 3.3.6 SDS-PAGE蛋白电泳验证 | 第52-53页 |
| 3.3.7 P3HP产量计算 | 第53页 |
| 3.3.8 P3HP的提取 | 第53页 |
| 3.3.9 重组菌K.p(pET-tac-pduP-tac-phaC)的上罐发酵 | 第53-54页 |
| 3.3.10 重组菌K.p(pET-tac-phaC-pduP)的构建 | 第54页 |
| 3.3.11 重组菌K.p(pET-tac-phaC-pduP)的摇瓶发酵 | 第54页 |
| 3.3.12 三株重组菌phaC的荧光定量PCR分析 | 第54页 |
| 3.4 结果和讨论 | 第54-68页 |
| 3.4.1 双启动子表达载体pET-tac-pduP-tac-phaC构建的PCR验证结果 | 第54-55页 |
| 3.4.2 重组菌K.p(pET-tac-pduP-tac-phaC)构建的菌落PCR验证结果 | 第55-56页 |
| 3.4.3 重组工程菌株K.p(pET-tac-pduP-tac-phaC)的摇瓶发酵及产物检测 | 第56-57页 |
| 3.4.4 气相色谱法检测P3HP结果 | 第57-58页 |
| 3.4.5 SDS-PAGE蛋白电泳结果 | 第58-59页 |
| 3.4.6 P3HP产量的计算 | 第59-61页 |
| 3.4.7 P3HP的提取 | 第61页 |
| 3.4.8 重组工程菌株K.p(pET-tac-pduP-tac-phaC)的上罐发酵 | 第61-64页 |
| 3.4.9 重组工程菌K.p(pET-tac-phaC-pduP)的构建结果 | 第64-65页 |
| 3.4.10 重组K.p(pET-tac-phaC-pduP)的摇瓶发酵结果 | 第65-67页 |
| 3.4.11 三株重组菌中phaC表达量的荧光定量分析结果 | 第67-68页 |
| 3.5 本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 丙酰辅酶A合成酶(PrpE)途径生产P3HP | 第69-79页 |
| 4.1 前言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料 | 第69-70页 |
| 4.2.1 菌株及载体 | 第69-70页 |
| 4.2.2 培养基及试剂 | 第70页 |
| 4.3 实验方法 | 第70-73页 |
| 4.3.1 分子生物学基本实验操作 | 第70页 |
| 4.3.2 prpE的克隆和表达载体pET-tac-prpE的构建 | 第70-71页 |
| 4.3.3 重组表达载体pET-tac-prpE-phaC的构建 | 第71页 |
| 4.3.4 重组载体pET-tac-prpE-phaC抗性替换 | 第71-72页 |
| 4.3.5 双质粒重组工程菌K.p(pET-tac-puuC)(pET-tac-prpE-phaC)的构建 | 第72页 |
| 4.3.6 双质粒重组工程菌K.p(pET-tac-puuC)(pET-tac-prpE-phaC)的发酵 | 第72-73页 |
| 4.3.7 SDS-PAGE验证蛋白表达 | 第73页 |
| 4.4 结果和讨论 | 第73-78页 |
| 4.4.1 prpE的克隆和表达载体pET-tac-prpE构建结果 | 第73-74页 |
| 4.4.2 重组表达载体pET-tac-prpE-phaC构建结果 | 第74页 |
| 4.4.3 重组载体pET-tac-prpE-phaC抗性替换结果 | 第74-75页 |
| 4.4.4 双质粒重组工程菌K.p(pET-tac-puuC)(pET-tac-prpE-phaC)构建结果 | 第75-76页 |
| 4.4.5 工程菌K.p(pET-tac-puuC)(pET-tac-prpE-phaC)发酵样品GC检测结果 | 第76-77页 |
| 4.4.6 工程菌K.p(pET-tac-puuC)(pET-tac-prpE-phaC)的SDS-PAGE结果 | 第77-78页 |
| 4.5 本章小结 | 第78-79页 |
| 第五章 课题总结与展望 | 第79-81页 |
| 5.1 总结 | 第79-80页 |
| 5.2 创新点 | 第80页 |
| 5.3 课题展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-87页 |
| 附录Ⅰ 试剂 | 第87-88页 |
| 附录Ⅱ 仪器 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-91页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第91-93页 |
| 导师和作者简介 | 第93-95页 |
| 附件 | 第95-97页 |
