| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 1 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 乳果糖简介 | 第9-11页 |
| 1.1.1 乳果糖的生理功能 | 第9页 |
| 1.1.2 乳果糖的应用 | 第9-10页 |
| 1.1.3 乳果糖的生产 | 第10-11页 |
| 1.2 纤维二糖差向异构酶的研究进展 | 第11-13页 |
| 1.2.1 纤维二糖差向异构酶的来源 | 第11页 |
| 1.2.2 纤维二糖差向异构酶的酶学性质 | 第11-12页 |
| 1.2.3 纤维二糖差向异构酶的结构特征 | 第12-13页 |
| 1.3 纤维二糖差向异构酶的固定化及分子生物学研究进展 | 第13-15页 |
| 1.3.1 纤维二糖差向异构酶的异源表达 | 第13-14页 |
| 1.3.2 纤维二糖差向异构酶的分子改造 | 第14页 |
| 1.3.3 纤维二糖差向异构酶的固定化 | 第14-15页 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第15-16页 |
| 1.4.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介 | 第15页 |
| 1.4.2 巴斯德毕赤酵母表达的影响因素 | 第15-16页 |
| 1.5 立题背景及意义 | 第16-17页 |
| 1.6 本课题研究内容 | 第17-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-28页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 引物 | 第18页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.5 培养基及主要溶液 | 第19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-24页 |
| 2.2.1 纤维二糖差向异构酶基因克隆 | 第19-20页 |
| 2.2.2 密码子优化 | 第20页 |
| 2.2.3 定点突变 | 第20-21页 |
| 2.2.4 纤维二糖差向异构酶及其突变体重组表达载体的构建 | 第21-22页 |
| 2.2.5 重组表达质粒的线性化及电转化 | 第22-23页 |
| 2.2.6 重组毕赤酵母的筛选与鉴定 | 第23页 |
| 2.2.7 重组纤维二糖差向异构酶的诱导表达 | 第23-24页 |
| 2.2.8 重组毕赤酵母菌的遗传稳定性 | 第24页 |
| 2.3 分析方法 | 第24-28页 |
| 2.3.1 生物量的测定 | 第24-25页 |
| 2.3.2 蛋白质浓度测定 | 第25页 |
| 2.3.3 纤维二糖差向异构酶异构化活力标准曲线的绘制： | 第25页 |
| 2.3.4 纤维二糖差向异构酶酶活力的测定 | 第25-26页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE分析 | 第26页 |
| 2.3.6 重组纤维二糖差向异构酶的纯化 | 第26页 |
| 2.3.7 重组酶酶学性质研究 | 第26-28页 |
| 3 结果与讨论 | 第28-45页 |
| 3.1 纤维二糖差向异构酶信号肽与糖基化预测 | 第28页 |
| 3.2 纤维二糖差向异构酶密码子优化 | 第28-29页 |
| 3.3 纤维二糖差向异构酶及其突变体重组表达载体的构建 | 第29-31页 |
| 3.3.1 pPIC9K-CsCEm表达载体的构建 | 第29-30页 |
| 3.3.2 pPIC9K-CsCEmt表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 3.4 重组毕赤酵母的鉴定及筛选 | 第31-33页 |
| 3.4.1 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-CsCEm的鉴定及筛选 | 第31-33页 |
| 3.4.2 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-CsCEmt的鉴定及筛选 | 第33页 |
| 3.4.3 重组毕赤酵母遗传稳定性验证 | 第33页 |
| 3.5 重组纤维二糖差向异构酶及突变体诱导表达条件优化 | 第33-37页 |
| 3.5.1 诱导起始时间对产酶的影响 | 第33-34页 |
| 3.5.2 甲醇浓度对产酶的影响 | 第34-35页 |
| 3.5.3 诱导温度对产酶的影响 | 第35页 |
| 3.5.4 初始pH值对产酶的影响 | 第35-36页 |
| 3.5.5 发酵时间对产酶的影响 | 第36-37页 |
| 3.6 重组纤维二糖差向异构酶及突变体的分离纯化 | 第37-40页 |
| 3.6.1 硫酸铵盐析 | 第37-38页 |
| 3.6.2 Q-Sepharose F.F.阴离子柱层析 | 第38-39页 |
| 3.6.3 酶的分子量 | 第39页 |
| 3.6.4 重组纤维二糖差向异构酶和突变体的纯化结果 | 第39-40页 |
| 3.7 重组纤维二糖差向异构酶酶学性质 | 第40-45页 |
| 3.7.1 pH对重组酶活力的影响 | 第40-41页 |
| 3.7.2 pH对重组酶稳定性的影响 | 第41页 |
| 3.7.3 温度对重组酶活力的影响 | 第41-42页 |
| 3.7.4 温度对重组酶稳定性的影响 | 第42-43页 |
| 3.7.5 金属离子和EDTA对重组酶活力的影响 | 第43-44页 |
| 3.7.6 重组酶动力学参数 | 第44页 |
| 3.7.7 重组酶制备乳果糖的研究 | 第44-45页 |
| 主要结论与展望 | 第45-47页 |
| 主要结论 | 第45-46页 |
| 展望 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-53页 |
| 附录一：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第53-54页 |
| 附录二：密码子优化统计分析 | 第54-55页 |
| 附录三：重组毕赤酵母GS115/CsCE诱导表达 | 第55-56页 |
| 附录四：重组毕赤酵母GS115/ CsCEm 4-19的诱导表达 | 第56页 |
