| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-22页 |
| ·立题意义 | 第10页 |
| ·国内外研究进展 | 第10-19页 |
| ·根霉脂肪酶 | 第10-11页 |
| ·脂肪酶底物特异性的意义与研究进展 | 第11-12页 |
| ·脂肪酶“盖子”结构的研究价值与进展 | 第12-13页 |
| ·华根霉脂肪酶的研究价值 | 第13页 |
| ·华根霉脂肪酶与米根霉脂肪酶，米黑根毛霉脂肪酶，黑曲霉阿魏酸酯酶的结构与性质比较 | 第13-14页 |
| ·酶分子改造策略及其最新研究进展 | 第14-16页 |
| ·毕赤酵母表达脂肪酶的突变文库筛选的研究进展 | 第16-19页 |
| ·本课题研究思路、研究内容和课题来源 | 第19-22页 |
| ·课题研究思路 | 第19页 |
| ·研究内容 | 第19-20页 |
| ·课题来源 | 第20-22页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第22-36页 |
| ·实验材料 | 第22-24页 |
| ·菌株与质粒 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22页 |
| ·培养基与溶液 | 第22-23页 |
| ·主要培养基 | 第22-23页 |
| ·主要储备液 | 第23页 |
| ·主要仪器 | 第23-24页 |
| ·实验方法 | 第24-36页 |
| ·毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法的建立 | 第24-27页 |
| ·组成型表达载体的构建 | 第24页 |
| ·组成型表达质粒的线性化 | 第24页 |
| ·毕赤酵母的电转化 | 第24-25页 |
| ·重组子的筛选 | 第25页 |
| ·重组毕赤酵母表达脂肪酶的发酵培养 | 第25页 |
| ·脂肪酶活力的测定 | 第25-26页 |
| ·产脂肪酶菌株高通量筛选方法的建立 | 第26页 |
| ·单插入和双交换筛选库的构建 | 第26页 |
| ·拷贝数的确定 | 第26-27页 |
| ·半理性设计突变株的构建与筛选 | 第27-29页 |
| ·“盖子”结构区域突变的proRCL 基因的构建 | 第27页 |
| ·盖子突变的proRCL 基因的电转化 | 第27-28页 |
| ·突变文库的筛选 | 第28页 |
| ·突变酶的碳链长度特异性测定 | 第28-29页 |
| ·理性设计各突变位点的分析预测 | 第29-30页 |
| ·理性设计突变株的构建与筛选 | 第30-32页 |
| ·盖子结构替换的proRCL 基因的构建 | 第30-31页 |
| ·盖子替换的proRCL 基因的电转化 | 第31-32页 |
| ·突变菌株的筛选 | 第32页 |
| ·突变菌株的发酵 | 第32页 |
| ·重组蛋白的分离纯化与酶学性质测定 | 第32-36页 |
| ·重组蛋白的分离纯化 | 第32-33页 |
| ·脂肪酶活力和磷脂酶活力的测定 | 第33页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第33页 |
| ·动力学参数的测定 | 第33页 |
| ·最适pH 和pH 稳定性的测定 | 第33页 |
| ·最适温度和温度稳定性的测定 | 第33-34页 |
| ·热稳定性的测定 | 第34页 |
| ·突变脂肪酶底物特异性的测定 | 第34-36页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第36-56页 |
| ·毕赤酵母组成型表达系统的构建及其高通量筛选方法的研究 | 第36-40页 |
| ·组成型表达载体pGAPK-proRCL 的构建 | 第36-38页 |
| ·组成型表达毕赤酵母GS115/pGAPK-proRCL Mut~S 的获得和鉴定 | 第38页 |
| ·组成型表达毕赤酵母GS15/pGAPK-proRCL Mut~S 的分泌表达 | 第38-39页 |
| ·组成型表达脂肪酶的毕赤酵母高通量筛选方法 | 第39-40页 |
| ·目的基因整合方式的选择 | 第40页 |
| ·盖子结构区域选择性突变菌株的构建与筛选 | 第40-43页 |
| ·序列和结构分析确定选突变位点 | 第40-41页 |
| ·突变文库的构建与筛选 | 第41-43页 |
| ·突变脂肪酶的脂肪酸链长特异性 | 第43页 |
| ·盖子替换突变酶的位点分析 | 第43-49页 |
| ·华根霉脂肪酶与其他根霉脂肪酶和酯酶的盖子序列比对 | 第43-44页 |
| ·突变酶突变位点的预测分析 | 第44-49页 |
| ·proRCLS4-30 突变位点分析 | 第45-46页 |
| ·proRCLS4-3M 突变位点分析 | 第46-47页 |
| ·proRCLS4-3N 突变位点分析 | 第47-49页 |
| ·盖子替换突变酶的构建与酶学性质研究 | 第49-56页 |
| ·盖子替换突变酶的构建与筛选 | 第49-50页 |
| ·突变脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究 | 第50-56页 |
| ·突变脂肪酶的分离纯化 | 第50页 |
| ·突变脂肪酶的动力学常数 | 第50-52页 |
| ·突变脂肪酶的甘油三酯酶活力与磷脂酶活力 | 第52-53页 |
| ·pH 对脂肪酶活力的影响和pH 对脂肪酶稳定性的影响 | 第53页 |
| ·温度对脂肪酶活力的影响和温度对脂肪酶稳定性的影响 | 第53-54页 |
| ·突变脂肪酶的热稳定性 | 第54页 |
| ·突变脂肪酶的脂肪酸链长特异性 | 第54-56页 |
| 主要结论与展望 | 第56-58页 |
| 1 主要结论 | 第56-57页 |
| 2 展望 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-66页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第66页 |
