| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第12-26页 |
| 1.1 孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿的理化性质 | 第12-13页 |
| 1.2 MG及其代谢物LMG的体内代谢及残留危害 | 第13页 |
| 1.2.1 MG的体内代谢研究 | 第13页 |
| 1.2.2 MG及其代谢产物LMG残留危害的研究 | 第13页 |
| 1.3 MG及其代谢产物LMG检测技术研究现状 | 第13-15页 |
| 1.3.1 分光光度法 | 第13-14页 |
| 1.3.2 高效液相色谱法 | 第14页 |
| 1.3.3 液质联用检测法 | 第14页 |
| 1.3.4 拉曼光谱法 | 第14-15页 |
| 1.3.5 免疫分析法 | 第15页 |
| 1.4 基因工程抗体在免疫分析中的研究进展 | 第15-18页 |
| 1.4.1 抗体的发展过程 | 第15-16页 |
| 1.4.2 基因工程抗体的主要分类 | 第16-17页 |
| 1.4.3 基因工程抗体在免疫检测中的应用 | 第17-18页 |
| 1.5 生物素-亲和素扩大系统 | 第18-22页 |
| 1.5.1 生物素和亲和素的理化性质 | 第18页 |
| 1.5.2 生物素-亲和素系统在免疫分析中的应用 | 第18页 |
| 1.5.3 生物素标记方法研究 | 第18-22页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第22-23页 |
| 1.7 研究内容及技术路线 | 第23-26页 |
| 1.7.1 研究内容 | 第23-25页 |
| 1.7.2 技术路线 | 第25-26页 |
| 2 材料 | 第26-32页 |
| 2.1 仪器与材料 | 第26-32页 |
| 2.1.1 主要仪器 | 第26-27页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.3 常用试剂配制 | 第28-30页 |
| 2.1.4 引物序列 | 第30-31页 |
| 2.1.5 质粒与菌株 | 第31页 |
| 2.1.6 pComb3xss载体 | 第31-32页 |
| 3 实验方法 | 第32-45页 |
| 3.1 重组载体pComb3xss-LMG-scFv-BirA的构建和鉴定 | 第32-37页 |
| 3.1.1 BirA酶基因的扩增和鉴定 | 第32-33页 |
| 3.1.2 LMG-scFv基因的扩增 | 第33页 |
| 3.1.3 pComb3xss-LMG-scFv-BirA的构建 | 第33-37页 |
| 3.1.4 pComb3xss-LMG-scFv-BirA的酶切鉴定 | 第37页 |
| 3.2 重组载体pComb3xss-LMG-Fab的构建和鉴定 | 第37-40页 |
| 3.2.1 κ 基因（VL+CL）构建（重叠延伸PCR法） | 第37-38页 |
| 3.2.2 Fd段基因（VH+CH）构建（重叠延伸PCR法） | 第38页 |
| 3.2.3 pComb3xss-LMG-Fab的构建 | 第38-40页 |
| 3.2.4 pComb3xss-LMG-Fab的酶切鉴定 | 第40页 |
| 3.3 重组载体p Comb3xss-LMG-scFab的构建和鉴定 | 第40-41页 |
| 3.3.1 scFab基因的构建（重叠延伸PCR法） | 第40页 |
| 3.3.2 pComb3xss-LMG-scFab的构建 | 第40-41页 |
| 3.3.3 scFab和质粒pComb3xss连接 | 第41页 |
| 3.3.4 pComb3xss-LMG-scFab的酶切鉴定 | 第41页 |
| 3.4 重组工程菌表达和鉴定 | 第41-43页 |
| 3.4.1 IPTG诱导表达 | 第41-42页 |
| 3.4.2 蔗糖渗透压破壁法提取周质蛋白 | 第42页 |
| 3.4.3 SDS-PAGE鉴定 | 第42-43页 |
| 3.4.4 Western Blotting鉴定 | 第43页 |
| 3.5 间接竞争ELISA法的建立 | 第43-44页 |
| 3.6 方法特异性评价 | 第44页 |
| 3.7 抗体稳定性分析 | 第44-45页 |
| 4 结果与分析 | 第45-57页 |
| 4.1 重组载体pComb3xss-LMG-scFv-BirA的构建及鉴定 | 第45-48页 |
| 4.1.1 BirA酶基因的扩增及鉴定 | 第45-46页 |
| 4.1.2 LMG-scFv基因的扩增 | 第46-47页 |
| 4.1.3 pComb3xss-LMG-scFv-BirA鉴定 | 第47-48页 |
| 4.2 重组载体pComb3xss-LMG-Fab的构建及鉴定 | 第48-50页 |
| 4.2.1 VL，VH，CL和CH1基因扩增 | 第48-49页 |
| 4.2.2 κ 基因和Fd基因构建 | 第49-50页 |
| 4.2.3 pComb3xss-LMG-Fab的鉴定 | 第50页 |
| 4.3 重组载体pComb3xss-LMG-scFab的构建及鉴定 | 第50-52页 |
| 4.3.1 scFab基因构建 | 第50-51页 |
| 4.3.2 pComb3xss-LMG-scFab的鉴定 | 第51-52页 |
| 4.4 三种重组菌的表达及鉴定 | 第52-54页 |
| 4.4.1 重组菌Top10f’-pComb3xss-LMG-scFv-BirA诱导表达及鉴定 | 第52-53页 |
| 4.4.2 重组菌Top10f’-Fab和Top10f’-scFab诱导表达及鉴定 | 第53-54页 |
| 4.5 基于三种重组抗体的间接竞争ELISA的建立 | 第54-55页 |
| 4.6 方法特异性评价 | 第55-56页 |
| 4.7 抗体稳定性分析 | 第56-57页 |
| 5 讨论与结论 | 第57-63页 |
| 5.1 讨论 | 第57-60页 |
| 5.1.1 BirA酶基因的扩增 | 第57-58页 |
| 5.1.2 两个目的序列在同一载体中共表达 | 第58-59页 |
| 5.1.3 生物素-亲和素系统对免疫检测法灵敏度的提高 | 第59页 |
| 5.1.4 关于scFab基因的构建 | 第59-60页 |
| 5.1.5 三种重组抗体的比较分析 | 第60页 |
| 5.2 结论 | 第60-61页 |
| 5.3 创新点 | 第61页 |
| 5.4 展望 | 第61-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 附录 作者攻读硕士学位的期间发表论文和专利情况 | 第70页 |
