| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-23页 |
| ·几丁质及其降解产物 | 第12-13页 |
| ·几丁质酶的研究进展 | 第13-18页 |
| ·几丁质酶的研究历史 | 第13页 |
| ·几丁质酶的分布 | 第13页 |
| ·几丁质酶的分类 | 第13-14页 |
| ·几丁质酶基因的结构 | 第14页 |
| ·几丁质酶基因的调节 | 第14-15页 |
| ·几丁质酶基因的克隆与表达 | 第15-17页 |
| ·几丁质酶的利用前景 | 第17-18页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第18-19页 |
| ·表达外源蛋白的优势 | 第18页 |
| ·影响外源基因高效表达的主要因素 | 第18-19页 |
| ·密码子偏爱性在异源蛋白表达中的应用 | 第19-20页 |
| ·实验选题依据、研究内容及技术路线 | 第20-23页 |
| ·选题依据 | 第20-21页 |
| ·研究内容 | 第21-22页 |
| ·技术路线 | 第22-23页 |
| 第二章 表达载体pPIC9K-SECH的构建 | 第23-39页 |
| ·材料 | 第23-24页 |
| ·质粒和菌株 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·试剂盒 | 第23页 |
| ·限制性内切酶及工具酶 | 第23页 |
| ·其他试剂 | 第23-24页 |
| ·仪器设备 | 第24页 |
| ·实验方法 | 第24-31页 |
| ·内切几丁质酶基因序列SECH的获得 | 第24-27页 |
| ·pPIC9K-SECH基因的构建 | 第27-29页 |
| ·重组质粒pPIC9K-SECH的鉴定 | 第29-31页 |
| ·重组质粒pPIC9K-SECH测序 | 第31页 |
| ·结果与分析 | 第31-36页 |
| ·PCR法合成内切几丁质酶基因序列SECH | 第31-32页 |
| ·重组质粒pPIC9K-SECH基因的构建 | 第32-33页 |
| ·SECH基因的双酶切 | 第33-34页 |
| ·pPIC9K载体双酶切 | 第34页 |
| ·转化子的筛选与鉴定 | 第34-35页 |
| ·测序结果与分析 | 第35-36页 |
| ·本章小结 | 第36-39页 |
| 第三章 重组内切几丁质酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第39-55页 |
| ·材料 | 第39-42页 |
| ·实验用菌株 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·试剂盒 | 第40页 |
| ·限制性内切酶 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40-41页 |
| ·蛋白质电泳试剂 | 第41-42页 |
| ·仪器设备 | 第42页 |
| ·实验方法 | 第42-47页 |
| ·重组质粒pPIC9K-SECH的提取 | 第42页 |
| ·重组质粒pPIC9K-SECH的线性化 | 第42-43页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第43页 |
| ·酵母电击转化 | 第43-44页 |
| ·重组酵母DNA的提取 | 第44页 |
| ·重组酵母DNA的PCR鉴定 | 第44-45页 |
| ·酶活初步测定 | 第45-46页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第46-47页 |
| ·结果与分析 | 第47-53页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-SECH质粒的提取 | 第47-48页 |
| ·质粒经印Bpu1102I单酶切后割胶回收结果 | 第48-49页 |
| ·酵母的电击转化及筛选 | 第49页 |
| ·重组酵母子的PCR鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组酵母酶活的初步测定 | 第50-52页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE及酶谱分析 | 第52-53页 |
| ·本章小结 | 第53-55页 |
| 第四章 重组巴斯德毕赤酵母摇瓶发酵生产几丁质酶条件优化的研究 | 第55-71页 |
| ·材料 | 第55-56页 |
| ·菌种 | 第55页 |
| ·培养基 | 第55页 |
| ·主要试剂 | 第55-56页 |
| ·仪器设备 | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56-59页 |
| ·摇瓶水平菌体培养及诱导表达 | 第56-57页 |
| ·粗酶液的制备 | 第57页 |
| ·内切几丁质酶活的测定 | 第57页 |
| ·离心后转接对几丁质酶活的影响 | 第57页 |
| ·甲醇浓度对内切几丁质酶活的影响 | 第57页 |
| ·油酸对内切几丁质酶酶的影响 | 第57-58页 |
| ·Tween-80对几丁质酶酶活的影响 | 第58页 |
| ·PTM_1浓度对内切几丁质酶活的影响 | 第58页 |
| ·不同pH对几丁质酶酶活的影响 | 第58页 |
| ·部分因子实验及响应而实验设计 | 第58-59页 |
| ·结果与分析 | 第59-70页 |
| ·离心后再转接对几丁质酶活的影响 | 第59-60页 |
| ·甲醇浓度对几丁质酶活的影响 | 第60-61页 |
| ·油酸浓度对内切几丁质酶活的影响 | 第61页 |
| ·Tween-80对内切几丁质酶活的影响 | 第61-62页 |
| ·PTM_1对内切几丁质酶活的影响 | 第62-63页 |
| ·pH对内切几丁质酶酶活的影响 | 第63页 |
| ·部分因子实验设计 | 第63-66页 |
| ·响应面分析的实验设计及结果 | 第66-68页 |
| ·最佳优化条件的确定及验证实验 | 第68-70页 |
| ·本章小结 | 第70-71页 |
| 第五章 结论 | 第71-73页 |
| ·结果 | 第71页 |
| ·创新点 | 第71-72页 |
| ·进一步研究的内容及建议 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 附录1 | 第80-83页 |
| 附录2 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |