| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第9-18页 |
| 1.1 引言 | 第9页 |
| 1.2 中度嗜盐微生物及相容性溶质 | 第9-10页 |
| 1.3 四氢嘧啶性质及合成途径 | 第10-11页 |
| 1.3.1 四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶性质 | 第10页 |
| 1.3.2 四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的合成途径 | 第10-11页 |
| 1.3.3 四氢嘧啶合成酶及基因结构 | 第11页 |
| 1.4 四氢嘧啶的转运及合成调节 | 第11-12页 |
| 1.4.1 四氢嘧啶转运系统 | 第11页 |
| 1.4.2 四氢嘧啶合成的调节 | 第11-12页 |
| 1.5 四氢嘧啶的功能及制备合成 | 第12-13页 |
| 1.5.1 四氢嘧啶的功能及应用 | 第12页 |
| 1.5.2 四氢嘧啶的制备方法 | 第12-13页 |
| 1.6 国内外相关研究 | 第13页 |
| 1.7 大肠杆菌高密度发酵 | 第13-14页 |
| 1.8 代谢育种思路 | 第14-15页 |
| 1.8.1 出发菌株的选择 | 第14页 |
| 1.8.2 代谢支路的构建及优化 | 第14页 |
| 1.8.3 增加前体物的供应 | 第14-15页 |
| 1.8.4 选育耐受性菌株 | 第15页 |
| 1.8.5 切断或减弱支路代谢 | 第15页 |
| 1.8.6 阻断进一步代谢 | 第15页 |
| 1.9 本研究的立题背景及研究内容 | 第15-18页 |
| 1.9.1 立题背景 | 第15-16页 |
| 1.9.2 本研究的主要内容 | 第16-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 菌株 | 第18-19页 |
| 2.1.2 质粒 | 第19页 |
| 2.2 主要仪器和试剂 | 第19-23页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第19-20页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第20-21页 |
| 2.2.3 主要溶液 | 第21-22页 |
| 2.2.4 培养基 | 第22-23页 |
| 2.2.5 抗生素及诱导剂 | 第23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-31页 |
| 2.3.1 质粒的小量提取 | 第23-24页 |
| 2.3.2 扩增DNA纯化回收 | 第24-25页 |
| 2.3.3 大肠杆菌基因组的提取 | 第25页 |
| 2.3.4 大肠杆菌化学转化法感受态的制备及转化实验 | 第25-26页 |
| 2.3.5 大肠杆菌电转化法感受态的制备及转化实验 | 第26页 |
| 2.3.6 基因PCR扩增 | 第26-28页 |
| 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳 | 第28页 |
| 2.3.8 质粒的构建 | 第28-29页 |
| 2.3.9 利用Red同源重组基因操作方法 | 第29页 |
| 2.3.10 发酵液中四氢嘧啶浓度的检测 | 第29页 |
| 2.3.11 四氢嘧啶工程菌培养条件 | 第29-31页 |
| 3 结果与讨论 | 第31-51页 |
| 3.1 大肠杆菌四氢嘧啶代谢支路的构建 | 第31-33页 |
| 3.1.1 重组质粒pTrcECT和pTrECT-S的构建 | 第31页 |
| 3.1.2 大肠杆菌中四氢嘧啶途径的构建 | 第31-32页 |
| 3.1.3 摇瓶发酵验证大肠杆菌中四氢嘧啶的合成 | 第32-33页 |
| 3.2 竞争抑制支路的阻断和弱化 | 第33-39页 |
| 3.2.1 基因lysA和thrA敲除片段的构建 | 第33-35页 |
| 3.2.2 敲除片段替换目的基因 | 第35-36页 |
| 3.2.3 抗性标记的删除 | 第36页 |
| 3.2.4 双敲菌W3110 △lysA △thrA的构建 | 第36页 |
| 3.2.5 四氢嘧啶工程菌ECT-06、ECT-07和ECT-08的构建 | 第36页 |
| 3.2.6 摇瓶发酵验证lysA和thrA基因缺陷的影响 | 第36-39页 |
| 3.3 回补天冬氨酸激酶 | 第39-43页 |
| 3.3.1 基因片段lysC_(cgl)~(GlA,C932T)和lysC_(eco)~(C1055T)的构建 | 第39-40页 |
| 3.3.2 质粒pSTVLysC-EC和pSTVLysC-CG的构建 | 第40-41页 |
| 3.3.3 四氢嘧啶工程菌ECT-09和ECT-10的构建 | 第41页 |
| 3.3.4 摇瓶发酵验证过表达天冬氨酸激酶的影响 | 第41-43页 |
| 3.4 增加前体物天冬氨酸的合成 | 第43-48页 |
| 3.4.1 基因iclR敲除片段的构建 | 第43页 |
| 3.4.2 敲除片段替换目的基因 | 第43页 |
| 3.4.3 抗性标记的删除 | 第43-44页 |
| 3.4.4 四氢嘧啶工程菌ECT-11的构建 | 第44页 |
| 3.4.5 摇瓶发酵验证iclR缺陷的影响 | 第44页 |
| 3.4.6 重组质粒pTrcPPC的构建 | 第44-45页 |
| 3.4.7 ppc基因启动子替换片段的构建 | 第45-46页 |
| 3.4.8 目的片段替换原始启动子 | 第46页 |
| 3.4.9 抗性标记的删除 | 第46-47页 |
| 3.4.10 四氢嘧啶工程菌ECT-12的构建 | 第47页 |
| 3.4.11 摇瓶发酵验证过表达ppc基因的影响 | 第47-48页 |
| 3.5 工程菌ECT-12的发酵罐培养验证 | 第48-49页 |
| 3.6 总结 | 第49-51页 |
| 4 结论 | 第51-52页 |
| 5 展望 | 第52-53页 |
| 6 参考文献 | 第53-60页 |
| 7 研究生期间所发表论文情况 | 第60-61页 |
| 8 致谢 | 第61页 |
