| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 引言 | 第15-25页 |
| 1.1 甾体化合物 | 第15-17页 |
| 1.1.1 甾体化合物概况 | 第15页 |
| 1.1.2 留体化合物及其发展史 | 第15-16页 |
| 1.1.3 留体化合物市场与AD、9a-0H AD | 第16-17页 |
| 1.2 甾体化合物的生产 | 第17-19页 |
| 1.2.1 甾体化合物的化学合成 | 第17页 |
| 1.2.2 甾体化合物的微生物转化 | 第17页 |
| 1.2.3 甾体药物工业生产的技术路线 | 第17-19页 |
| 1.3 甾醇微生物转化的研究进展与趋势 | 第19-22页 |
| 1.3.1 研究进展 | 第19-21页 |
| 1.3.2 甾体转化研究趋势 | 第21-22页 |
| 1.4 甾体微生物转化的困境与出路 | 第22-24页 |
| 1.4.1 甾体微生物转化的困境 | 第22页 |
| 1.4.2 解决方法 | 第22-24页 |
| 1.5 本课题的研究内容与研究目的 | 第24-25页 |
| 第二章 大孔吸附树脂对分枝杆菌转化甾醇生产甾体医药中间体的促进作用 | 第25-45页 |
| 2.1 前言 | 第25页 |
| 2.2 实验材料 | 第25-27页 |
| 2.2.1 菌株与载体 | 第25-26页 |
| 2.2.3 主要实验仪器 | 第26页 |
| 2.2.4 培养基及各类配制溶液 | 第26-27页 |
| 2.2.5 菌种保藏 | 第27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-28页 |
| 2.3.1 树脂的预处理与再生 | 第27页 |
| 2.3.2 树脂的添加 | 第27页 |
| 2.3.3 发酵过程的控制 | 第27页 |
| 2.3.4 底物甾醇与产物AD和9α-OH AD的分析 | 第27-28页 |
| 2.4 结果 | 第28-42页 |
| 2.4.1 分枝杆菌转化甾醇高浓度底物毒害、产物抑制与产物降解现象 | 第28-31页 |
| 2.4.2 树脂对对转化的促进作用 | 第31-32页 |
| 2.4.3 树脂的添加对菌株R10和HK86的转化甾醇的影响 | 第32-34页 |
| 2.4.3.1 产物保护 | 第32页 |
| 2.4.3.2 解除产物抑制 | 第32-34页 |
| 2.4.3.3 缓解高浓度底物毒害 | 第34页 |
| 2.4.4 树脂添加对菌体转化能力的促进作用 | 第34-37页 |
| 2.4.5 树脂的优化 | 第37-42页 |
| 2.4.5.1、树脂参与过程的优化 | 第37-38页 |
| 2.4.5.2、树脂解吸附过程的优化 | 第38-40页 |
| 2.4.5.3、树脂再生方法的优化 | 第40页 |
| 2.4.5.4、国产替代树脂的筛选 | 第40-42页 |
| 2.5 本章小结与讨论 | 第42-45页 |
| 第三章 甾体转运系统的强化 | 第45-54页 |
| 3.1 前言 | 第45-46页 |
| 3.2 实验材料 | 第46-47页 |
| 3.2.1 菌株与载体 | 第46页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第46页 |
| 3.2.3 主要实验仪器 | 第46-47页 |
| 3.2.4 培养基及各类配制溶液 | 第47页 |
| 3.2.5 菌种保藏 | 第47页 |
| 3.2.6 实验引物 | 第47页 |
| 3.3 实验方法 | 第47-49页 |
| 3.3.1 M.neoaurum MS基因组的提取制备 | 第47-48页 |
| 3.3.2 PCR扩增 | 第48页 |
| 3.3.3 质粒抽提 | 第48页 |
| 3.3.4 DNA片段纯化 | 第48页 |
| 3.3.5 DNA酶切与连接 | 第48-49页 |
| 3.3.6、大肠杆菌DH5α转化 | 第49页 |
| 3.3.7 分枝杆菌R10的感受态制备 | 第49页 |
| 3.3.8 质粒电击转化导入分枝杆菌感受态 | 第49页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第49-53页 |
| 3.4.1 目的基因sup4/B的钓取 | 第49-50页 |
| 3.4.2 携带目的基因sup4A/B的重组质粒 | 第50-51页 |
| 3.4.2.1 重组质粒的构建 | 第50页 |
| 3.4.2.2 重组质粒验证 | 第50-51页 |
| 3.4.3 携带重组质粒的工程菌构建 | 第51-52页 |
| 3.4.5 工程菌表型验证结果 | 第52-53页 |
| 3.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 耐受高浓度底物的菌株筛选 | 第54-58页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.2.1 菌株与载体 | 第54页 |
| 4.2.3 主要实验仪器 | 第54页 |
| 4.2.4 培养基及各类配制溶液 | 第54页 |
| 4.2.5 菌种保藏 | 第54-55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-56页 |
| 4.3.1 原始菌种培养复苏 | 第55页 |
| 4.3.2 原始菌种发酵培养 | 第55页 |
| 4.3.3 耐受高浓度底物菌株的驯化 | 第55页 |
| 4.3.4 耐受高浓度底物菌株的驯化与筛选 | 第55页 |
| 4.3.4.1 高浓度底物并抗性平板的制备 | 第55页 |
| 4.3.4.2 耐受高浓度底物的菌株筛选 | 第55页 |
| 4.3.5 高浓度底物耐受性的验证 | 第55-56页 |
| 4.3.6 将实验步奏3、4、5进行不停地循环富集筛选 | 第56页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第56页 |
| 4.4.1 耐受高浓度底物的HK86菌株的驯化筛选 | 第56页 |
| 4.4.2 R10菌株的高浓度底物耐受性筛选 | 第56页 |
| 4.5 本章小结 | 第56-58页 |
| 第五章 甾醇转化促进剂的筛选 | 第58-62页 |
| 5.1 引言 | 第58页 |
| 5.2 实验材料 | 第58-59页 |
| 5.2.1 菌株与载体 | 第58页 |
| 5.2.2 实验试剂 | 第58页 |
| 5.2.3 主要实验仪器 | 第58页 |
| 5.2.4 培养基及各类配制溶液 | 第58-59页 |
| 5.2.5 菌种保藏 | 第59页 |
| 5.3 实验方法 | 第59页 |
| 5.3.1 原始菌种培养复苏 | 第59页 |
| 5.3.2 甾体转化促进剂的筛选 | 第59页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第59-61页 |
| 5.5 本章小结 | 第61-62页 |
| 第六章 分子杆菌无标记基因敲除工具的构建 | 第62-73页 |
| 6.1 引言 | 第62-63页 |
| 6.2 实验材料 | 第63页 |
| 6.2.1 菌株与载体 | 第63页 |
| 6.2.2 实验试剂 | 第63页 |
| 6.2.3 主要实验仪器 | 第63页 |
| 6.2.4 培养基及各类配制溶液 | 第63页 |
| 6.2.5 菌种保藏 | 第63页 |
| 6.2.6 实验引物 | 第63页 |
| 6.3 实验方法 | 第63-69页 |
| 6.3.1 提高同源重组效率的pFQ质粒构建 | 第63-65页 |
| 6.3.1.1 Pimyc-tetR阻遏蛋白和Che9c gp60-61重组蛋白基因钓取 | 第63页 |
| 6.3.1.2 pFQ质粒的构建 | 第63-65页 |
| 6.3.2 pFQ-Xer质粒片段的构建 | 第65-66页 |
| 6.3.2.1 dif+kan抗性基因和Hsp60启动子基因的钓取 | 第65-66页 |
| 6.3.3 同源重组片段的构建 | 第66-67页 |
| 6.3.3.1 kstR3同源臂构建于puc-19T载体上 | 第66-67页 |
| 6.3.3.2 kstR3同源重组片段构建 | 第67页 |
| 6.3.4 无标记敲除系统的构建与验证 | 第67-69页 |
| 6.3.4.1 构建pFQ-MS工程菌 | 第67-68页 |
| 6.3.4.2 kstR3同源交换重组工程菌筛选 | 第68页 |
| 6.3.4.3 kanamycin抗性删除的工程菌筛选 | 第68-69页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第69-71页 |
| 6.4.1 Pimyc-tetR阻遏蛋白和Che9c gp60-61重组蛋白基因钓取结果 | 第69页 |
| 6.4.2 dif+kan和Hsp60基因钓取结果 | 第69页 |
| 6.4.3 pFQ质粒的构建验证结果 | 第69-70页 |
| 6.4.4 pFQ-xer质粒构建结果 | 第70页 |
| 6.4.5 kstR3基因同源臂上下游基因片段的钓取结果 | 第70页 |
| 6.4.6 pFQ-MS工程菌电泳验证 | 第70-71页 |
| 6.4.7 kstR3同源交换重组工程菌的筛选 | 第71页 |
| 6.4.8 进一步实验规划 | 第71页 |
| 6.5 本章小结 | 第71-73页 |
| 第七章 结论与展望 | 第73-76页 |
| 7.1 主要结论 | 第73-74页 |
| 7.1.1 大孔吸附树脂对分枝杆菌转化甾醇生产甾体医药中间体的促进作用 | 第73页 |
| 7.1.2 甾体转运系统的强化 | 第73-74页 |
| 7.1.3 耐受高浓度底物的菌株筛选 | 第74页 |
| 7.1.4 甾体转化促进剂的筛选 | 第74页 |
| 7.1.5 分枝杆菌无标记敲除系统的构建 | 第74页 |
| 7.2 展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
