| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第1章 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 选题意义 | 第13页 |
| 1.2 血栓疾病及其防治 | 第13-15页 |
| 1.3 蚓激酶研究现状 | 第15-17页 |
| 1.3.1 蚓激酶简介 | 第15页 |
| 1.3.2 蚓激酶溶栓机制 | 第15-16页 |
| 1.3.3 蚓激酶的性质 | 第16页 |
| 1.3.4 蚓激酶的功能性开发及临床应用 | 第16-17页 |
| 1.4 乳酸克鲁维酵母表达系统概况 | 第17-18页 |
| 1.4.1 乳酸克鲁维酵母简介 | 第17页 |
| 1.4.2 乳酸克鲁维酵母外源蛋白表达系统 | 第17-18页 |
| 1.5 毕赤酵母表达系统概况 | 第18-20页 |
| 1.5.1 巴斯德毕赤酵母简介 | 第18-19页 |
| 1.5.2 毕赤酵母外源表达系统 | 第19页 |
| 1.5.3 毕赤酵母高密度发酵 | 第19-20页 |
| 1.6 蚓激酶基因工程研究进展 | 第20-21页 |
| 1.6.1 蚓激酶基因 | 第20页 |
| 1.6.2 蚓激酶的异源表达研究 | 第20-21页 |
| 1.7 研究目的及内容 | 第21-23页 |
| 1.7.1 研究目的 | 第21页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第21-23页 |
| 第2章 蚓激酶基因的克隆及分析 | 第23-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 蚯蚓样本 | 第23页 |
| 2.1.2 实验菌种及质粒载体 | 第23页 |
| 2.1.3 分子试剂 | 第23页 |
| 2.1.4 实验设备及药品 | 第23-25页 |
| 2.1.5 培养基及溶液 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-28页 |
| 2.2.1 蚯蚓样本处理 | 第25页 |
| 2.2.2 蚯蚓基因组的提取 | 第25页 |
| 2.2.3 蚯蚓18S基因序列的扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.4 提取蚯蚓总RNA | 第26页 |
| 2.2.5 蚓激酶cDNA单链的合成 | 第26页 |
| 2.2.6 蚓激酶基因的克隆 | 第26-27页 |
| 2.2.7 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 2.2.8 蚓激酶基因、18SrDNA与pMD18-T载体的连接与转化 | 第27-28页 |
| 2.2.9 阳性转化子的验证 | 第28页 |
| 2.2.10 18SrDNA及蚓激酶序列的生物信息学分析 | 第28页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第28-34页 |
| 2.3.1 野生蚯蚓种属鉴定 | 第28-29页 |
| 2.3.2 蚯蚓总RNA的提取和蚓激酶基因的克隆 | 第29-31页 |
| 2.3.3 蚓激酶lks2基因序列分析 | 第31-34页 |
| 2.4 小结 | 第34-35页 |
| 第3章 蚓激酶基因lks2在乳酸克鲁维酵母GG799中的表达 | 第35-50页 |
| 3.1 实验材料 | 第35-37页 |
| 3.1.1 菌种与质粒 | 第35页 |
| 3.1.2 实验药品与设备 | 第35-36页 |
| 3.1.3 培养基及溶液试剂 | 第36-37页 |
| 3.2 实验方法 | 第37-41页 |
| 3.2.1 pKLAC1质粒的提取 | 第37页 |
| 3.2.2 lks2基因的扩增 | 第37-38页 |
| 3.2.3 pKLAC1-lks2表达载体的构建 | 第38页 |
| 3.2.4 重组菌GG799-pKLAC1-lks2的构建 | 第38-39页 |
| 3.2.5 阳性转化子的筛选及验证 | 第39-40页 |
| 3.2.6 纤维蛋白平板的制作及尿激酶标准曲线的制备 | 第40页 |
| 3.2.7 重组菌GG799-pKLAC1-lks2的发酵验证 | 第40页 |
| 3.2.8 发酵液SDS-PAGE电泳分析 | 第40页 |
| 3.2.9 重组菌的培养基优化 | 第40-41页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第41-49页 |
| 3.3.1 质粒pKLAC1的提取 | 第41-42页 |
| 3.3.2 重组质粒pKLAC1-lks2的构建 | 第42-43页 |
| 3.3.3 转化子的筛选和验证 | 第43-44页 |
| 3.3.4 尿激酶标准曲线 | 第44页 |
| 3.3.5 重组菌GG799-pKLAC1-lks2的发酵 | 第44-45页 |
| 3.3.6 发酵液SDS-PANG电泳分析 | 第45-46页 |
| 3.3.7 重组菌的培养基优化 | 第46-49页 |
| 3.4 小结 | 第49-50页 |
| 第4章 蚓激酶基因lks2在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达及发酵条件优化 | 第50-61页 |
| 4.1 实验材料 | 第50-51页 |
| 4.1.1 菌种和质粒 | 第50页 |
| 4.1.2 试剂 | 第50页 |
| 4.1.4 培养基与溶液试剂 | 第50-51页 |
| 4.2 实验方法 | 第51-54页 |
| 4.2.1 pPIC9K质粒的提取 | 第51页 |
| 4.2.2 lks2基因的扩增 | 第51-52页 |
| 4.2.3 pPIC9K-lks2表达载体的构建 | 第52页 |
| 4.2.4 重组菌GS115-pPIC9K-lks2的构建 | 第52-53页 |
| 4.2.5 阳性转化子的筛选及验证 | 第53页 |
| 4.2.6 重组菌GS115-pPIC9K-lks2的发酵及表达验证 | 第53页 |
| 4.2.7 重组菌GS115-pPIC9K-lks2摇瓶发酵条件优化 | 第53-54页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第54-60页 |
| 4.3.1 质粒pPIC9K的提取及lks2基因的扩增 | 第54-55页 |
| 4.3.2 pPIC9K-lks2表达载体的构建 | 第55页 |
| 4.3.3 巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞的制备及转化 | 第55-56页 |
| 4.3.4 阳性转化子的筛选及传代 | 第56-57页 |
| 4.3.5 重组菌GS115-pPIC9K-lks2的发酵 | 第57页 |
| 4.3.6 重组菌GS115-pPIC9K-lks2的摇瓶发酵条件优化 | 第57-60页 |
| 4.4 小结 | 第60-61页 |
| 第5章 毕赤酵母重组菌GS115-pPIC9K-lks2高密度发酵 | 第61-70页 |
| 5.1 实验材料 | 第61-63页 |
| 5.1.1 菌种 | 第61页 |
| 5.1.2 实验药品与设备 | 第61-62页 |
| 5.1.3 培养基及溶液试剂 | 第62-63页 |
| 5.2 实验方法 | 第63-64页 |
| 5.2.1 蛋白质标准曲线的制备 | 第63页 |
| 5.2.2 蚓激酶毕赤酵母重组菌高密度发酵 | 第63页 |
| 5.2.3 菌体初始浓度优化 | 第63页 |
| 5.2.4 添加酵母浸粉对产酶影响 | 第63页 |
| 5.2.5 高密度发酵SDS-PAGE分析 | 第63页 |
| 5.2.6 高密度发酵过程控制 | 第63-64页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第64-69页 |
| 5.3.1 蛋白质标准曲线 | 第64页 |
| 5.3.2 菌体初始浓度优化 | 第64-66页 |
| 5.3.3 酵母浸粉添加量的优化 | 第66-67页 |
| 5.3.4 重组菌高密度发酵SDS-PAGE分析 | 第67-68页 |
| 5.3.5 高密度发酵过程控制 | 第68-69页 |
| 5.4 小结 | 第69-70页 |
| 第6章 结论与展望 | 第70-72页 |
| 结论 | 第70-71页 |
| 展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-81页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
