| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第1章 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 β-半乳糖苷酶 | 第13-17页 |
| 1.1.1 β-半乳糖苷酶来源及特性 | 第13-14页 |
| 1.1.2 β-半乳糖苷酶催化机制 | 第14-16页 |
| 1.1.3 β-半乳糖苷酶异源表达 | 第16页 |
| 1.1.4 β-半乳糖苷酶的应用 | 第16-17页 |
| 1.2 低聚半乳糖 | 第17-20页 |
| 1.2.1 低聚半乳糖结构与功能 | 第17-18页 |
| 1.2.2 低聚半乳糖制备与生产 | 第18-19页 |
| 1.2.3 低聚半乳糖应用 | 第19-20页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第20-21页 |
| 1.3.1 巴斯德毕赤酵母系统特点 | 第20页 |
| 1.3.2 宿主菌与表达载体的选择 | 第20-21页 |
| 1.4 研究目的与意义 | 第21页 |
| 1.5 研究内容 | 第21-23页 |
| 第2章 草酸青霉 β-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第23-47页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-26页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第23页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.3 分子生物学试剂 | 第24页 |
| 2.2.4 主要试剂 | 第24-25页 |
| 2.2.5 培养基 | 第25-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-34页 |
| 2.3.1 草酸青霉总RNA的提取及cDNA的合成 | 第26页 |
| 2.3.2 引物的设计 | 第26-27页 |
| 2.3.3 β-半乳糖苷酶基因（GalA）的克隆和重组克隆载体的构建 | 第27-28页 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第28-29页 |
| 2.3.5 阳性重组子的鉴定与测序 | 第29-30页 |
| 2.3.6 重组表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.7 重组表达载体线性化 | 第31-32页 |
| 2.3.8 毕赤酵母感受态细胞的制备和转化 | 第32-33页 |
| 2.3.9 重组毕赤酵母的筛选与鉴定 | 第33页 |
| 2.3.10 重组 β -半乳糖苷酶的诱导表达 | 第33页 |
| 2.3.11 β-半乳糖苷酶活性的测定 | 第33-34页 |
| 2.3.12 SDS-PAGE蛋白电泳分析和蛋白含量的测定 | 第34页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第34-45页 |
| 2.4.1 RNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.4.2 β-半乳糖苷酶基因的克隆 | 第35-36页 |
| 2.4.3 重组克隆载体（pMD19-T-GalA）的构建 | 第36-37页 |
| 2.4.4 阳性重组子的筛选及鉴定 | 第37-38页 |
| 2.4.5 阳性重组子的测序 | 第38-39页 |
| 2.4.6 重组表达载体（pPICZαA-GalA）的构建 | 第39-40页 |
| 2.4.7 阳性重组子的筛选及鉴定 | 第40-41页 |
| 2.4.8 重组表达载体（pPICZαA-GalA）线性化 | 第41-42页 |
| 2.4.9 多拷贝阳性重组子的筛选和鉴定 | 第42-44页 |
| 2.4.10 阳性重组子产物分析 | 第44-45页 |
| 2.5 本章小结 | 第45-47页 |
| 第3章 重组 β-半乳糖苷酶发酵条件优化及分离纯化 | 第47-61页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 实验材料 | 第47-48页 |
| 3.2.1 菌株 | 第47页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第47页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第47页 |
| 3.2.4 培养基 | 第47-48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48-50页 |
| 3.3.1 接种量对产酶的影响 | 第48页 |
| 3.3.2 甲醇添加量对产酶的影响 | 第48页 |
| 3.3.3 诱导初始pH对产酶的影响 | 第48页 |
| 3.3.4 诱导温度对产酶的影响 | 第48页 |
| 3.3.5 诱导时间对产酶的影响 | 第48页 |
| 3.3.6 硫酸铵盐析 | 第48-49页 |
| 3.3.7 透析脱盐 | 第49页 |
| 3.3.8 离子交换柱层析 | 第49页 |
| 3.3.9 温度对重组酶活性及稳定性的影响 | 第49页 |
| 3.3.10 pH对重组酶活性及稳定性的影响 | 第49-50页 |
| 3.3.11 金属离子、EDTA和SDS对酶活性的影响 | 第50页 |
| 3.3.12 动力学参数K_m和V_(max)的测定 | 第50页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第50-59页 |
| 3.4.1 接种量对产酶的影响 | 第50-51页 |
| 3.4.2 甲醇添加量对产酶的影响 | 第51-52页 |
| 3.4.3 诱导初始pH对产酶的影响 | 第52-53页 |
| 3.4.4 诱导温度对产酶的影响 | 第53页 |
| 3.4.5 诱导时间对产酶的影响 | 第53-54页 |
| 3.4.6 硫酸铵盐析浓度的确定 | 第54页 |
| 3.4.7 SDS-PAGE分析 | 第54-55页 |
| 3.4.8 蛋白分离纯化结果 | 第55页 |
| 3.4.9 重组酶的最适温度和温度稳定性 | 第55-57页 |
| 3.4.10 重组酶的最适pH值及pH稳定性 | 第57-58页 |
| 3.4.11 金属离子、EDTA和SDS对酶活性的影响 | 第58-59页 |
| 3.4.12 酶的动力学参数 | 第59页 |
| 3.5 本章小结 | 第59-61页 |
| 第4章 重组 β-半乳糖苷酶转糖苷合成低聚半乳糖 | 第61-73页 |
| 4.1 引言 | 第61页 |
| 4.2 实验材料 | 第61-62页 |
| 4.2.1 菌株 | 第61-62页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第62页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第62页 |
| 4.2.4 培养基 | 第62页 |
| 4.3 实验方法 | 第62-64页 |
| 4.3.1 乳糖的水解 | 第62-63页 |
| 4.3.2 低聚半乳糖（GOS）的合成 | 第63页 |
| 4.3.3 乳糖添加量对合成GOS的影响 | 第63页 |
| 4.3.4 加酶量对合成GOS的影响 | 第63页 |
| 4.3.5 酶促反应时间对合成GOS的影响 | 第63页 |
| 4.3.6 低聚半乳糖含量的测定 | 第63页 |
| 4.3.7 薄层层析（TLC）分析 | 第63-64页 |
| 4.3.8 母乳中低聚糖的测定 | 第64页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第64-70页 |
| 4.4.1 与市售 β-半乳糖苷酶水解乳糖的比较 | 第64-65页 |
| 4.4.2 初始乳糖浓度对GOS合成的影响 | 第65-66页 |
| 4.4.3 酶的添加量对GOS合成的影响 | 第66-67页 |
| 4.4.4 酶促反应时间对GOS合成的影响 | 第67页 |
| 4.4.5 TLC结果分析 | 第67-68页 |
| 4.4.6 LC-MS结果分析 | 第68页 |
| 4.4.7 合成的低聚半乳糖同母乳中低聚糖的对比分析 | 第68-70页 |
| 4.5 本章小结 | 第70-73页 |
| 第5章 结论与展望 | 第73-75页 |
| 5.1 结论 | 第73-74页 |
| 5.2 展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 致谢 | 第83-85页 |
| 在学期间主要研究成果 | 第85页 |
