| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第10-21页 |
| 1.1 引言 | 第10页 |
| 1.2 α-酮基丁酸的理化性质 | 第10页 |
| 1.3 α-酮基丁酸的应用 | 第10-14页 |
| 1.3.1 α-酮基丁酸在食品工业的应用 | 第11-12页 |
| 1.3.2 α-酮基丁酸在医药工业的应用 | 第12-14页 |
| 1.4 α-酮基丁酸的生产方法 | 第14-15页 |
| 1.4.1 化学合成法生产α-酮基丁酸 | 第14页 |
| 1.4.2 酶催化法生产α-酮基丁酸 | 第14-15页 |
| 1.4.3 发酵法生产α-酮基丁酸 | 第15页 |
| 1.5 α-酮基丁酸的合成途径 | 第15-17页 |
| 1.5.1 苏氨酸途径 | 第15-16页 |
| 1.5.2 甲基苹果酸途径 | 第16-17页 |
| 1.6 代谢育种思路 | 第17-19页 |
| 1.6.1 出发菌株的选择 | 第17-18页 |
| 1.6.2 苏氨酸途径的延伸 | 第18页 |
| 1.6.3 增加前体物的供应 | 第18页 |
| 1.6.4 阻断或弱化支路代谢 | 第18页 |
| 1.6.5 新合成途径的引入 | 第18-19页 |
| 1.6.6 选育耐受性菌株 | 第19页 |
| 1.6.7 诱导系统的选择 | 第19页 |
| 1.7 论文研究意义和主要内容 | 第19-21页 |
| 1.7.1 论文研究意义 | 第19页 |
| 1.7.2 论文主要内容 | 第19-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-22页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第21-22页 |
| 2.2 主要仪器和试剂 | 第22-26页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第22-23页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第23-24页 |
| 2.2.3 主要溶液 | 第24-25页 |
| 2.2.4 培养基 | 第25-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-35页 |
| 2.3.1 质粒小剂量提取 | 第26页 |
| 2.3.2 DNA纯化回收 | 第26页 |
| 2.3.3 大肠杆菌基因组提取 | 第26-27页 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第27-28页 |
| 2.3.5 PCR扩增 | 第28-30页 |
| 2.3.6 重组质粒的构建 | 第30页 |
| 2.3.7 利用Red同源重组基因敲除方法 | 第30-31页 |
| 2.3.8 琼脂糖凝胶电泳 | 第31页 |
| 2.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第31-32页 |
| 2.3.10 有机酸及苏氨酸含量的测定 | 第32-33页 |
| 2.3.11 大肠杆菌的驯化实验及筛选方法 | 第33页 |
| 2.3.12 工程菌培养条件及分析测定方法 | 第33-35页 |
| 3 结果与讨论 | 第35-69页 |
| 3.1 α-酮基丁酸生产菌的构建 | 第35-39页 |
| 3.1.1 大肠杆菌THRW和THRT的构建 | 第35-37页 |
| 3.1.2 ilvA过表达对α-酮基丁酸发酵的影响 | 第37-39页 |
| 3.2 前体物苏氨酸转运系统的改造 | 第39-44页 |
| 3.2.1 菌株THRW-1、THRW-2和THRW-3的构建 | 第39-40页 |
| 3.2.2 苏氨酸转运系统的改造对THRW生产α-酮基丁酸的影响 | 第40-42页 |
| 3.2.3 副产物丙酮酸的验证 | 第42-44页 |
| 3.3 α-酮基丁酸代谢途径的改造 | 第44-54页 |
| 3.3.1 基因ilvIH和ilvBN的敲除 | 第44-47页 |
| 3.3.2 菌株THRW-4、THRW-5和THRW-6的构建 | 第47页 |
| 3.3.3 基因ilvIH和ilvBN的敲除对α-酮基丁酸发酵的影响 | 第47-49页 |
| 3.3.4 基因tdcE和avtA的敲除 | 第49-52页 |
| 3.3.5 基因tdcE和avtA的对α-酮基丁酸发酵的影响 | 第52-53页 |
| 3.3.6 IPTG诱导时间的优化 | 第53-54页 |
| 3.4 甲基苹果酸途径的引入 | 第54-58页 |
| 3.4.1 菌株THRW-4-S1(THRW-4+pSTV28-cimA)的构建 | 第55-56页 |
| 3.4.2 菌株THRW-4-S2(THRW-4+ pSTV28-cimA-leuBCD)的构建 | 第56-57页 |
| 3.4.3 引入甲基苹果酸途径对大肠杆菌发酵α-酮基丁酸的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.4 关于以上实验的思考与讨论 | 第58页 |
| 3.5 大肠杆菌THRW-4的适应性进化实验 | 第58-62页 |
| 3.5.1 大肠杆菌对α-酮基丁酸耐受能力的测定 | 第58-59页 |
| 3.5.2 菌株THRW-4的驯化和筛选实验 | 第59-60页 |
| 3.5.3 高耐受性突变株的发酵实验 | 第60-62页 |
| 3.6 温控α-酮基丁酸生产菌株的构建 | 第62-67页 |
| 3.6.1 温控重组大肠杆菌THRB-4的构建 | 第62-64页 |
| 3.6.2 重组菌THRB-4温控条件的优化 | 第64-67页 |
| 3.7 小结 | 第67-69页 |
| 4 结论 | 第69-71页 |
| 5 展望 | 第71-72页 |
| 6 参考文献 | 第72-78页 |
| 7 研究生期间发表论文 | 第78-79页 |
| 8 致谢 | 第79页 |
