| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第11-24页 |
| 1.1 引言 | 第11页 |
| 1.2 L-苏氨酸的理化性质及应用 | 第11-12页 |
| 1.2.1 L-苏氨酸的理化性质 | 第11页 |
| 1.2.2 L-苏氨酸的应用 | 第11-12页 |
| 1.3 L-苏氨酸的生产方法及生产概况 | 第12-13页 |
| 1.3.1 L-苏氨酸的生产方法 | 第12页 |
| 1.3.2 L-苏氨酸生产概况 | 第12-13页 |
| 1.4 国内外直接发酵法生产L-苏氨酸的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.5 乙醛酸循环的改造 | 第14-15页 |
| 1.6 丙酮酸代谢途径的改造 | 第15-16页 |
| 1.7 NADPH的合成方法 | 第16-19页 |
| 1.7.1 磷酸戊糖途径合成NADPH | 第17页 |
| 1.7.2 TCA途径合成NADPH | 第17页 |
| 1.7.3 NAD激酶合成NADPH | 第17-18页 |
| 1.7.4 转氢酶系统合成NADPH | 第18页 |
| 1.7.5 NADPH合成的其他方式 | 第18-19页 |
| 1.8 代谢流量分析概述 | 第19-20页 |
| 1.8.1 ~(13)C代谢流分析 | 第19-20页 |
| 1.8.2 代谢平衡法 | 第20页 |
| 1.9 L-苏氨酸的发酵优化 | 第20-21页 |
| 1.10 立题背景及主要内容 | 第21-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-25页 |
| 2.2 主要仪器和试剂 | 第25-28页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第25-26页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第26-27页 |
| 2.2.3 主要溶液 | 第27-28页 |
| 2.2.4 抗生素 | 第28页 |
| 2.2.5 培养基 | 第28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-39页 |
| 2.3.1 质粒的小剂量提取 | 第28页 |
| 2.3.2 DNA纯化回收 | 第28-29页 |
| 2.3.3 大肠杆菌基因组的提取 | 第29页 |
| 2.3.4 大肠杆菌化学转化法感受态的制备及转化实验 | 第29-30页 |
| 2.3.5 大肠杆菌电转化法感受态的制备及转化实验 | 第30页 |
| 2.3.6 PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳 | 第31-32页 |
| 2.3.8 质粒的构建 | 第32页 |
| 2.3.9 Red同源重组基因敲除方法 | 第32-33页 |
| 2.3.10 重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳 | 第33-34页 |
| 2.3.11 总RNA的提取和实时荧光定量PCR | 第34-35页 |
| 2.3.12 胞内NADPH测定 | 第35页 |
| 2.3.13 3-磷酸甘油醛脱氢酶活力的测定 | 第35-36页 |
| 2.3.14 代谢流量分析 | 第36-37页 |
| 2.3.15 高效液相色谱法测定发酵液中的氨基酸含量 | 第37页 |
| 2.3.16 高效液相色谱法测定发酵液中的有机酸含量 | 第37页 |
| 2.3.17 大肠杆菌发酵L-苏氨酸的培养条件及分析测定方法 | 第37-39页 |
| 3 结果与讨论 | 第39-73页 |
| 3.1 大肠杆菌THRD乙醛酸途径的改造 | 第39-46页 |
| 3.1.1 大肠杆菌THRDΔiclR突变株的构建 | 第39-41页 |
| 3.1.2 aceBAK启动子的替换及鉴定 | 第41-44页 |
| 3.1.3 实时定量PCR分析 | 第44页 |
| 3.1.4 iclR的敲除及aceBAK启动子的替换对L-苏氨酸发酵的影响 | 第44-46页 |
| 3.1.5 乙醛酸途径的改造对L-苏氨酸产量影响的讨论 | 第46页 |
| 3.2 大肠杆菌THRD丙酮酸代谢途径的改造 | 第46-57页 |
| 3.2.1 外源丙酮酸羧化酶基因的克隆与筛选 | 第46-49页 |
| 3.2.2 外源丙酮酸羧化酶基因的诱导表达及SDS-PAGE分析 | 第49-50页 |
| 3.2.3 大肠杆菌THRD+pWSK29-SpycA的构建 | 第50-51页 |
| 3.2.4 大肠杆菌THRD pykF:pycA突变株的构建 | 第51-53页 |
| 3.2.5 外源丙酮酸羧化酶基因的表达对L-苏氨酸发酵的影响 | 第53-56页 |
| 3.2.6 丙酮酸代谢途径的改造对L-苏氨酸产量影响的讨论 | 第56-57页 |
| 3.3 大肠杆菌THRD胞内NADPH再生 | 第57-67页 |
| 3.3.1 大肠杆菌THRD gapA::gapC突变株的构建 | 第57-58页 |
| 3.3.2 gapC替换gapA对L-苏氨酸发酵的影响 | 第58-59页 |
| 3.3.3 gapA的替换对E.coli THRD发酵L-苏氨酸的影响 | 第59-60页 |
| 3.3.4 gapA的替换对NADPH生成的影响 | 第60-61页 |
| 3.3.5 发酵过程中GAPDH酶活力的变化 | 第61-62页 |
| 3.3.6 苏氨酸合成代谢流量分析 | 第62-67页 |
| 3.3.7 总结 | 第67页 |
| 3.4 大肠杆菌THRD发酵L-苏氨酸条件优化 | 第67-73页 |
| 3.4.1 培养基中添加甜菜碱对L-苏氨酸发酵的影响 | 第67-70页 |
| 3.4.2 苏氨酸合成代谢流量分析 | 第70-73页 |
| 4 结论 | 第73-74页 |
| 5 展望 | 第74-75页 |
| 6 参考文献 | 第75-82页 |
| 7 研究生期间所发表论文情况 | 第82-83页 |
| 8 致谢 | 第83页 |
