重组毕赤酵母高效表达细菌亮氨酸氨肽酶及发酵优化
| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| ·氨肽酶概述 | 第9-12页 |
| ·氨肽酶的定义 | 第9页 |
| ·氨肽酶的来源 | 第9-10页 |
| ·氨肽酶的分类 | 第10-11页 |
| ·氨肽酶的应用 | 第11-12页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第12-15页 |
| ·毕赤酵母表达系统简介 | 第12-13页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优缺点 | 第13-14页 |
| ·毕赤酵母表达系统的糖基化修饰 | 第14页 |
| ·毕赤酵母的发酵工艺 | 第14-15页 |
| ·国内外研究进展 | 第15-16页 |
| ·国外研究进展 | 第15页 |
| ·国内研究进展 | 第15-16页 |
| ·立题意义 | 第16页 |
| ·本论文主要研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-29页 |
| ·材料 | 第18-19页 |
| ·菌株与质粒 | 第18页 |
| ·主要试剂 | 第18页 |
| ·主要仪器 | 第18-19页 |
| ·培养基 | 第19页 |
| ·方法 | 第19-25页 |
| ·大肠杆菌工程菌的培养 | 第19页 |
| ·含目的基因BSAP的质粒的提取 | 第19-20页 |
| ·BSAP的扩增 | 第20页 |
| ·目的基因和质粒的双酶切 | 第20页 |
| ·双酶切产物的胶回收 | 第20页 |
| ·重组质粒的连接与转化 | 第20页 |
| ·E.coli JM109 感受态细胞的制备 | 第20-21页 |
| ·感受态细胞的热激转化 | 第21页 |
| ·核酸琼脂糖凝胶电泳 | 第21页 |
| ·重组表达菌株的菌落PCR验证 | 第21-22页 |
| ·重组质粒的PCR鉴定 | 第22页 |
| ·重组质粒的双酶切验证 | 第22页 |
| ·重组质粒的DNA测序 | 第22页 |
| ·重组载体pPIC9K-BSAP的线性化 | 第22页 |
| ·毕赤酵母GS115 感受态细胞的制备 | 第22页 |
| ·毕赤酵母GS115 感受态细胞的电转化 | 第22-23页 |
| ·重组毕赤酵母的平板筛选 | 第23页 |
| ·重组毕赤酵母的发酵培养 | 第23页 |
| ·重组毕赤酵母的发酵优化 | 第23-24页 |
| ·重组毕赤酵母的高拷贝筛选 | 第24-25页 |
| ·重组毕赤酵母的遗传稳定性分析 | 第25页 |
| ·分析方法 | 第25-29页 |
| ·细胞光密度的测定 | 第25页 |
| ·菌体湿重的测定 | 第25页 |
| ·重组氨肽酶酶活的测定 | 第25-26页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第26页 |
| ·重组氨肽酶的分离纯化 | 第26-27页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第27页 |
| ·重组氨肽酶的酶学性质研究 | 第27-28页 |
| ·MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析 | 第28页 |
| ·重组氨肽酶的去糖基化处理 | 第28页 |
| ·圆二色谱分析糖基化对重组氨肽酶的二级结构影响 | 第28页 |
| ·重组氨肽酶的应用初探 | 第28-29页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第29-54页 |
| ·产亮氨酸氨肽酶重组毕赤酵母的构建 | 第29-33页 |
| ·氨肽酶基因的克隆及表达载体的构建 | 第29-30页 |
| ·重组毕赤酵母的构建与筛选 | 第30-31页 |
| ·重组毕赤酵母的高拷贝筛选 | 第31页 |
| ·重组毕赤酵母的表达验证 | 第31-32页 |
| ·重组毕赤酵母的SDS-PAGE验证 | 第32页 |
| ·重组毕赤酵母的遗传稳定性验证 | 第32-33页 |
| ·重组毕赤酵母的摇瓶发酵优化 | 第33-37页 |
| ·重组毕赤酵母的生长曲线 | 第33页 |
| ·诱导起始时间对产氨肽酶的影响 | 第33-34页 |
| ·诱导甲醇浓度对产氨肽酶的影响 | 第34页 |
| ·摇瓶装液量对产氨肽酶的影响 | 第34-35页 |
| ·诱导初始pH对产氨肽酶的影响 | 第35-36页 |
| ·诱导温度和时间对产氨肽酶的影响 | 第36页 |
| ·山梨醇添加量对重组毕赤酵母产氨肽酶的影响 | 第36-37页 |
| ·重组毕赤酵母产氨肽酶的分离纯化 | 第37-39页 |
| ·硫酸铵盐析 | 第37页 |
| ·Hitrp Q HP阴离子交换层析 | 第37-38页 |
| ·Sephadex G-75 凝胶过滤 | 第38页 |
| ·SDS-PAGE鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组氨肽酶分离纯化结果 | 第39页 |
| ·重组氨肽酶的糖基化分析 | 第39-43页 |
| ·氨肽酶蛋白序列糖基化位点的的预测 | 第39-40页 |
| ·MALDI-TOF质谱分析 | 第40-41页 |
| ·重组氨肽酶的去糖基化分析 | 第41-42页 |
| ·圆二色谱分析糖基化对氨肽酶的结构影响 | 第42-43页 |
| ·重组氨肽酶的酶学性质 | 第43-48页 |
| ·重组氨肽酶最适反应温度 | 第43页 |
| ·重组氨肽酶的温度稳定性 | 第43-44页 |
| ·重组氨肽酶的最适pH | 第44页 |
| ·重组氨肽酶的pH稳定性 | 第44-45页 |
| ·金属离子及蛋白酶抑制剂对重组氨肽酶的影响 | 第45-46页 |
| ·重组氨肽酶的底物特异性 | 第46-47页 |
| ·重组氨肽酶动力学参数Km和Vmax的测定 | 第47-48页 |
| ·重组毕赤酵母的 7 L罐发酵条件的初步优化 | 第48-51页 |
| ·甘油分批补料发酵阶段 | 第48-49页 |
| ·初始诱导生物量对重组氨肽酶表达量的影响 | 第49-51页 |
| ·重组氨肽酶的应用初探 | 第51-54页 |
| ·单酶和双酶酶解液中游离氨基酸的比较 | 第51-53页 |
| ·单酶和双酶酶解液中分子量分布比较 | 第53-54页 |
| 主要结论与展望 | 第54-56页 |
| 主要结论 | 第54-55页 |
| 展望 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第63页 |
| 申请国家发明专利 | 第63-64页 |
| 标准曲线 | 第64页 |
