| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| ·引言 | 第12页 |
| ·香精香料的发展趋势 | 第12-13页 |
| ·香精香料的简介 | 第12页 |
| ·香精香料的发展 | 第12-13页 |
| ·乙偶姻理化性质及生理意义 | 第13-14页 |
| ·乙偶姻的理化性质 | 第13-14页 |
| ·乙偶姻的生理意义 | 第14页 |
| ·乙偶姻的应用 | 第14-15页 |
| ·乙偶姻生产方法及研究概况 | 第15-17页 |
| ·化学合成法 | 第15页 |
| ·酶转化法 | 第15-16页 |
| ·微生物发酵法 | 第16-17页 |
| ·乙偶姻相关代谢途径与代谢调控 | 第17-20页 |
| ·乙偶姻相关代谢途径 | 第17-19页 |
| ·乙偶姻代谢途径的改造研究 | 第19-20页 |
| ·本论文立题意义与目的 | 第20页 |
| ·本论文研究思路与主要内容 | 第20-22页 |
| 第二章 高产乙偶姻枯草芽孢杆菌的筛选与鉴定 | 第22-35页 |
| ·引言 | 第22页 |
| ·材料和方法 | 第22-26页 |
| ·样品采集 | 第22页 |
| ·实验试剂与设备 | 第22-23页 |
| ·培养基和培养条件 | 第23页 |
| ·菌株初筛流程 | 第23-24页 |
| ·菌株复筛流程 | 第24页 |
| ·细菌DNA的提取 | 第24页 |
| ·PCR反应及其产物回收 | 第24页 |
| ·菌株的生理生化鉴定及 16S rDNA分析 | 第24-25页 |
| ·GC-MC定性分析发酵液主要产物 | 第25页 |
| ·发酵参数分析方法 | 第25页 |
| ·菌株生长曲线的绘制 | 第25页 |
| ·最适种龄和最佳接种量的选择 | 第25-26页 |
| ·结果与讨论 | 第26-33页 |
| ·样品初筛 | 第26页 |
| ·样品复筛 | 第26-27页 |
| ·菌株 3-1 和 3-10 发酵生产乙偶姻的能力比较 | 第27-28页 |
| ·菌株 3-10 主要发酵产物的GC-MS检测 | 第28页 |
| ·菌株 3-10 的生理生化及透射电镜鉴定结果 | 第28-30页 |
| ·JNA 3-10 生长曲线的绘制 | 第30页 |
| ·最佳接种时间和最适接种量的选择 | 第30-31页 |
| ·葡萄糖浓度对菌株JNA 3-10 生产乙偶姻的影响 | 第31页 |
| ·发酵温度和初始pH对菌株JNA 3-10 生产乙偶姻的影响 | 第31-32页 |
| ·5 L发酵罐乙偶姻发酵结果 | 第32-33页 |
| ·本章小结 | 第33-35页 |
| 第三章 高产乙偶姻枯草芽孢杆菌突变株的选育及其机理探讨 | 第35-48页 |
| ·引言 | 第35页 |
| ·材料与方法 | 第35-39页 |
| ·实验试剂、仪器、培养基与培养条件 | 第35-36页 |
| ·制备菌悬液 | 第36页 |
| ·紫外（UV）致死诱变剂量的选择 | 第36页 |
| ·硫酸二乙酯（DES）致死诱变剂量的选择 | 第36页 |
| ·UV和DES复合诱变方法 | 第36页 |
| ·BDH缺失型枯草芽孢杆菌筛选原理及方法 | 第36-37页 |
| ·粗酶液制备及AR/BDH酶活力检测 | 第37页 |
| ·枯草芽孢杆菌染色体的提取 | 第37页 |
| ·枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻实验 | 第37页 |
| ·感受细胞的态制备与转化 | 第37-38页 |
| ·bdhA基因的克隆及敲除 | 第38-39页 |
| ·发酵参数分析方法 | 第39页 |
| ·结果与讨论 | 第39-47页 |
| ·B. subtilis JNA3-10 UV致死曲线 | 第39-40页 |
| ·B. subtilis JNA3-10 DES致死曲线 | 第40页 |
| ·UV或DES单独诱变结果 | 第40-41页 |
| ·UV和DES复合诱变初筛结果 | 第41页 |
| ·UV和DES复合诱变复筛结果 | 第41-43页 |
| ·JNA-UD-6 的bdhA基因序列分析 | 第43页 |
| ·JNA-UD-6 的发酵特征 | 第43-44页 |
| ·bdhA基因的敲除对JNA 3-10 发酵生产乙偶姻的影响 | 第44-47页 |
| ·本章小结 | 第47-48页 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌乙偶姻合成途径代谢流的加强 | 第48-63页 |
| ·引言 | 第48-49页 |
| ·材料与方法 | 第49-52页 |
| ·菌株、质粒与引物 | 第49-50页 |
| ·主要试剂、相关培养基与培养条件 | 第50页 |
| ·枯草芽孢杆菌染色体的提取 | 第50页 |
| ·PCR反应及其产物回收 | 第50页 |
| ·感受态细胞的制备与转化 | 第50页 |
| ·重组菌构建及验证 | 第50页 |
| ·重组菌蛋白表达及总蛋白浓度测定 | 第50-51页 |
| ·ALS及ALDC酶活检测分析 | 第51页 |
| ·组氨酸标签蛋白的Ni-NTA纯化 | 第51-52页 |
| ·酶学性质的初步分析 | 第52页 |
| ·发酵参数分析方法 | 第52页 |
| ·结果与讨论 | 第52-61页 |
| ·枯草芽孢杆菌JNA 3-10 alsS和alsD基因的克隆及其序列分析 | 第52页 |
| ·大肠杆菌重组表达质粒pET28a-alsS和pET28a-alsD的构建 | 第52-53页 |
| ·重组大肠杆菌的SDS-PAGE分析 | 第53-54页 |
| ·ALS和ALDC的蛋白纯化 | 第54页 |
| ·ALS和ALDC的酶学性质分析 | 第54-59页 |
| ·增强表达ALS和ALDC对枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻的影响 | 第59-61页 |
| ·本章小结 | 第61-63页 |
| ·主要结论 | 第61-62页 |
| ·展望 | 第62-63页 |
| 第五章 适度表达正向调控蛋白ALsR加强乙偶姻的合成 | 第63-78页 |
| ·引言 | 第63-64页 |
| ·材料与方法 | 第64-69页 |
| ·菌株、质粒与引物 | 第64-65页 |
| ·主要试剂、相关培养基与培养条件 | 第65页 |
| ·枯草芽孢杆菌染色体的提取 | 第65页 |
| ·PCR反应及其产物回收 | 第65页 |
| ·感受态细胞的制备与转化 | 第65-66页 |
| ·重组质粒的构建 | 第66-68页 |
| ·GFP表达检测 | 第68页 |
| ·CAT酶活检测分析 | 第68页 |
| ·重组菌蛋白表达及SDS-PAGE分析 | 第68页 |
| ·RNA的提取和cDNA合成 | 第68页 |
| ·RT-PCR引物设计原则 | 第68-69页 |
| ·RT-PCR操作 | 第69页 |
| ·发酵参数分析方法 | 第69页 |
| ·结果与讨论 | 第69-76页 |
| ·启动子HpaII和PbdhA活力的定性比较 | 第69-71页 |
| ·启动子HpaII和PbdhA活力的定量比较 | 第71-72页 |
| ·增强ALsR的表达对提高发酵过程中ALS和ALDC酶活力的作用 | 第72-75页 |
| ·增强ALsR的表达对乙偶姻发酵的影响 | 第75-76页 |
| ·本章小结 | 第76-78页 |
| 第六章 利用辅因子工程降低乙偶姻发酵过程中NADH依赖型副产物的合成 | 第78-88页 |
| ·引言 | 第78-79页 |
| ·材料与方法 | 第79-81页 |
| ·菌株、质粒与引物 | 第79-80页 |
| ·主要试剂、相关培养基与培养条件 | 第80页 |
| ·枯草芽孢杆菌染色体的提取 | 第80页 |
| ·PCR反应及其产物回收 | 第80页 |
| ·感受态细胞的制备与转化 | 第80页 |
| ·NOX酶活力测定方法 | 第80页 |
| ·重组菌蛋白表达及SDS-PAGE分析 | 第80页 |
| ·酶纯化方法 | 第80页 |
| ·NOX酶学性质分析方法 | 第80-81页 |
| ·胞内NADH和NAD+含量的检测 | 第81页 |
| ·发酵参数分析方法 | 第81页 |
| ·结果与讨论 | 第81-87页 |
| ·枯草芽孢杆菌NOX编码基因的克隆与鉴定 | 第81页 |
| ·YODC（NOX）的纯化 | 第81-82页 |
| ·NOX的酶学性质分析 | 第82-83页 |
| ·NOX的表达对枯草芽孢杆菌生长的影响 | 第83-84页 |
| ·NOX的表达对细胞NADH/NAD+的影响 | 第84-85页 |
| ·NOX的表达对枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻和 2,3-丁二醇的影响 | 第85-86页 |
| ·NOX的表达对枯草芽孢杆菌发酵过程中其它主要副产物的影响 | 第86-87页 |
| ·本章小结 | 第87-88页 |
| 第七章 代谢工程策略构建高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌 | 第88-99页 |
| ·引言 | 第88-89页 |
| ·材料与方法 | 第89-91页 |
| ·菌株、质粒与引物 | 第89-90页 |
| ·主要试剂、相关培养基与培养条件 | 第90页 |
| ·枯草芽孢杆菌染色体的提取 | 第90页 |
| ·PCR反应及其产物回收 | 第90页 |
| ·重组质粒构建过程 | 第90-91页 |
| ·感受态细胞的制备与转化 | 第91页 |
| ·PFK和PK的酶活力测定方法 | 第91页 |
| ·胞内ATP和NADH的检测方法 | 第91页 |
| ·发酵参数分析方法 | 第91页 |
| ·结果与讨论 | 第91-98页 |
| ·重组菌的构建及其相关酶活力检测 | 第91-93页 |
| ·PFKA和PK的表达对乙偶姻发酵的影响 | 第93-94页 |
| ·PFKA和PK的表达对胞内ATP和NADH含量的影响 | 第94-95页 |
| ·整合代谢工程策略构建高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌 | 第95-97页 |
| ·本论文利用代谢工程策略构建高产乙偶姻枯草芽孢杆菌进展 | 第97-98页 |
| ·本章小结 | 第98-99页 |
| 主要结论与展望 | 第99-102页 |
| 主要结论 | 第99-100页 |
| 展望 | 第100-102页 |
| 论文创新点 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-111页 |
| 附录 Ⅰ: 英文简写缩略表 | 第111-112页 |
| 附录 Ⅱ: 核苷酸序列 | 第112-116页 |
| 附录 Ⅲ: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第116页 |
