| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| ·概述 | 第11-16页 |
| ·血清胆固醇水平与人体健康密切相关 | 第11页 |
| ·胆盐的肠肝循环及微生物代谢 | 第11-13页 |
| ·胆盐水解酶的来源 | 第13页 |
| ·胆盐水解酶的活性位点 | 第13-14页 |
| ·胆盐水解酶的功能与应用 | 第14-16页 |
| ·国内外研究概况及发展趋势 | 第16-21页 |
| ·益生菌的降胆固醇作用研究 | 第16页 |
| ·产胆盐水解酶菌株的筛选 | 第16-17页 |
| ·胆盐水解酶基因的克隆和表达 | 第17-18页 |
| ·胆盐水解酶的分离纯化和酶学性质研究 | 第18-20页 |
| ·胆盐水解酶的空间结构 | 第20-21页 |
| ·本论文主要研究内容 | 第21-23页 |
| ·立题依据和研究意义 | 第21页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第21-23页 |
| 第二章 产胆盐水解酶乳酸菌的筛选、鉴定以及 bsh 基因在 E. coli 胞内的表达 | 第23-37页 |
| ·前言 | 第23-24页 |
| ·材料与方法 | 第24-29页 |
| ·菌株、质粒和引物 | 第24-25页 |
| ·试剂及仪器 | 第25-26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·产 BSH 菌株的定性筛选 | 第26页 |
| ·产 BSH 菌株的定量筛选 | 第26-28页 |
| ·筛到的菌株的遗传学鉴定 | 第28页 |
| ·DNA 操作 | 第28页 |
| ·bsh 基因在 E. coli 胞内的克隆和表达 | 第28-29页 |
| ·结果 | 第29-34页 |
| ·产胆盐水解酶菌株的平板筛选 | 第29-30页 |
| ·菌株胆盐水解酶活性的测定 | 第30-31页 |
| ·菌株体外脱除胆固醇能力的测定 | 第31-32页 |
| ·菌株的遗传学鉴定 | 第32页 |
| ·bsh 基因的克隆和分析 | 第32-33页 |
| ·重组 BSH 在 E. coli 中的胞内表达 | 第33-34页 |
| ·讨论 | 第34-35页 |
| ·本章小结 | 第35-37页 |
| 第三章 利用双精氨酸信号肽将 bsh 基因在 E. coli 中进行分泌表达 | 第37-49页 |
| ·前言 | 第37-38页 |
| ·材料与方法 | 第38-41页 |
| ·菌株、质粒和引物 | 第38-39页 |
| ·试剂与仪器 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| ·信号肽物理化学性质的分析 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的构建 | 第40页 |
| ·重组蛋白的表达分析 | 第40页 |
| ·BSH 活性和蛋白含量测定 | 第40页 |
| ·胞外 BSH 活性的发酵优化 | 第40-41页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性测定 | 第41页 |
| ·结果 | 第41-46页 |
| ·重组菌的构建 | 第41-42页 |
| ·双精氨酸信号肽对 BSH 的胞内表达的影响 | 第42-43页 |
| ·双精氨酸信号肽对 BSH 分泌表达的影响 | 第43-45页 |
| ·E. coli BL21 (DE3) pLysS (pET-20b(+)-dmsA-bsh)胞外 BSH 活性的优化 | 第45页 |
| ·通过β-半乳糖苷酶活性检测细胞渗漏 | 第45-46页 |
| ·讨论 | 第46-47页 |
| ·信号肽的理化性质影响其分泌效率 | 第46-47页 |
| ·宿主对目的蛋白的分泌有很大影响 | 第47页 |
| ·重组 BSH 形成包涵体且分泌效率低的原因及解决方法 | 第47页 |
| ·本章小结 | 第47-49页 |
| 第四章 重组 BSH 的分离纯化及其酶学性质研究 | 第49-58页 |
| ·前言 | 第49页 |
| ·材料与方法 | 第49-52页 |
| ·菌株 | 第49页 |
| ·试剂与仪器 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49-50页 |
| ·重组 BSH 的发酵生产 | 第50页 |
| ·胞外重组 BSH 的分离纯化 | 第50-51页 |
| ·分析方法 | 第51页 |
| ·重组 BSH 的酶学性质研究 | 第51-52页 |
| ·结果与讨论 | 第52-56页 |
| ·重组 BSH 的纯化和 N 端测序 | 第52-53页 |
| ·BSH 最适反应 pH 和 pH 稳定性的测定 | 第53页 |
| ·BSH 最适反应温度和热稳定性的测定 | 第53-54页 |
| ·各种螯合剂、抑制剂和金属离子对酶活的影响 | 第54-55页 |
| ·BSH 的底物特异性 | 第55-56页 |
| ·酶反应动力学参数的测定 | 第56页 |
| ·本章小结 | 第56-58页 |
| 第五章 通过定点突变改变 BSH 的底物特异性 | 第58-69页 |
| ·前言 | 第58页 |
| ·材料与方法 | 第58-60页 |
| ·菌株、质粒和引物 | 第58-59页 |
| ·试剂与仪器 | 第59页 |
| ·氨基酸序列比对和 3-D 结构同源模拟 | 第59页 |
| ·DNA 操作 | 第59-60页 |
| ·突变菌株的构建 | 第60页 |
| ·突变体的纯化 | 第60页 |
| ·分析方法 | 第60页 |
| ·结果 | 第60-65页 |
| ·氨基酸序列比对和分子改造位点分析 | 第60-63页 |
| ·胆盐水解酶 3-D 同源结构模拟 | 第63页 |
| ·突变体的表达与纯化 | 第63-64页 |
| ·野生 BSH 与突变体的底物特异性 | 第64-65页 |
| ·野生 BSH 与突变体的动力学参数 | 第65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| ·本章小结 | 第67-69页 |
| 第六章 BSH 在乳酸乳球菌胞内和胞外的食品级表达 | 第69-81页 |
| ·前言 | 第69-70页 |
| ·材料与方法 | 第70-73页 |
| ·菌株 | 第70页 |
| ·试剂与仪器 | 第70-71页 |
| ·培养基 | 第71页 |
| ·DNA 操作 | 第71-72页 |
| ·重组质粒的构建 | 第72-73页 |
| ·BSH 在 L. lactis NZ3900 中的表达 | 第73页 |
| ·分析方法 | 第73页 |
| ·结果 | 第73-78页 |
| ·表达质粒的构建 | 第73-75页 |
| ·密码子优化对 BSH 表达的影响 | 第75-77页 |
| ·前导肽 LEISSTCDA 提高了 BSH 的分泌效率 | 第77-78页 |
| ·前导肽 LEISSTCDA 的作用机理 | 第78页 |
| ·讨论 | 第78-80页 |
| ·本章小结 | 第80-81页 |
| 结论 | 第81-83页 |
| 论文创新点 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-95页 |
| 附录：作者在读博期间发表的论文 | 第95页 |
