| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 目录 | 第5-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-15页 |
| 1.1 纳豆简介 | 第8页 |
| 1.2 纳豆激酶 | 第8-13页 |
| 1.2.1 纳豆激酶的结构 | 第8-9页 |
| 1.2.2 生化特性 | 第9页 |
| 1.2.3 溶栓作用机理 | 第9-10页 |
| 1.2.4 纳豆激酶活性测定的方法 | 第10-12页 |
| 1.2.5 纳豆激酶基因工程研究进展 | 第12页 |
| 1.2.6 纳豆激酶的开发现状及应用前景 | 第12-13页 |
| 1.3 酶的分子改造 | 第13-14页 |
| 1.3.1 酶分子改造的研究方法 | 第13-14页 |
| 1.3.2 酶分子改造的应用 | 第14页 |
| 1.4 本课题的研究意义和主要的研究内容 | 第14-15页 |
| 1.4.1 本课题的研究意义 | 第14页 |
| 1.4.2 本课题的主要研究内容 | 第14-15页 |
| 第二章 材料与方法 | 第15-24页 |
| 2.1 材料 | 第15-17页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第15页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第15页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第15页 |
| 2.1.4 培养基 | 第15-16页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第16-17页 |
| 2.2 纳豆激酶的表达与纯化方法 | 第17-20页 |
| 2.2.1 纳豆芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第17页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第17页 |
| 2.2.3 目的片段及载体纯化 | 第17页 |
| 2.2.4 大肠杆菌表达系统重组表达载体pET-24a-pro-nk的构建 | 第17页 |
| 2.2.5 大肠杆菌高效感受态的制备 | 第17-18页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态热击转化方法 | 第18页 |
| 2.2.7 大肠杆菌表达系统中目的蛋白的诱导表达 | 第18页 |
| 2.2.8 大肠杆菌表达系统中目的蛋白的纯化 | 第18页 |
| 2.2.9 枯草芽孢杆菌表达系统中重组载体的构建 | 第18-19页 |
| 2.2.10 枯草杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第19-20页 |
| 2.2.11 枯草芽孢杆菌表达系统中目的蛋白的表达及活性分析 | 第20页 |
| 2.2.12 枯草杆菌表达系统中目的蛋白的纯化 | 第20页 |
| 2.3 纳豆激酶的酶学性质分析 | 第20-22页 |
| 2.3.1 纳豆激酶活性测定 | 第20-21页 |
| 2.3.2 纳豆激酶最适温度的测定 | 第21页 |
| 2.3.3 纳豆激酶最适pH的测定 | 第21页 |
| 2.3.4 纳豆激酶热稳定性的测定 | 第21页 |
| 2.3.5 纳豆激酶pH稳定性的测定 | 第21-22页 |
| 2.4 纳豆激酶定点突变 | 第22-24页 |
| 2.4.1 点突变PCR引物 | 第22页 |
| 2.4.2 全质粒PCR扩增方法 | 第22页 |
| 2.4.3 全质粒PCR产物转化大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的方法 | 第22-23页 |
| 2.4.4 突变体表达及纯化方法 | 第23页 |
| 2.4.5 热稳定性提高突变体的初步筛选 | 第23页 |
| 2.4.6 原始纳豆激酶及突变体在65℃下热稳定性的测定 | 第23页 |
| 2.4.7 P14L、N76D突变体同源建模 | 第23页 |
| 2.4.8 P14L、N76D突变体分子动力学分析 | 第23-24页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第24-38页 |
| 3.1 纳豆激酶在大肠杆菌中的表达 | 第24-26页 |
| 3.1.1 重组质粒pET-24a-pro-nk的构建 | 第24-25页 |
| 3.1.2 重组纳豆激酶的表达 | 第25-26页 |
| 3.1.3 重组纳豆激酶的纤溶活性分析 | 第26页 |
| 3.2 纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第26-30页 |
| 3.2.1 重组质粒pMA0911-x-pro-nk的构建(x分别代表wapA、yncM、pre) | 第27-28页 |
| 3.2.2 重组质粒分泌表达及活性测定 | 第28-30页 |
| 3.3 枯草芽孢杆菌和大肠杆菌表达体系的重组纳豆激酶的纯化与酶活比较 | 第30-31页 |
| 3.4 枯草芽孢杆菌重组纳豆激酶的酶学性质分析 | 第31-33页 |
| 3.4.1 纳豆激酶的最适温度 | 第31-32页 |
| 3.4.2 纳豆激酶的最适pH | 第32页 |
| 3.4.3 纳豆激酶的热稳定性 | 第32-33页 |
| 3.4.4 纳豆激酶的pH稳定性 | 第33页 |
| 3.5 纳豆激酶热稳定性改造 | 第33-38页 |
| 3.5.1 热稳定性改造突变点设计 | 第33-34页 |
| 3.5.2 突变体初步筛选 | 第34页 |
| 3.5.3 突变体P14L、N76D纯化及酶活测定 | 第34-35页 |
| 3.5.4 各突变体热稳定性测定 | 第35页 |
| 3.5.5 热稳定性提高的突变酶的耐热机理分析 | 第35-38页 |
| 主要结论与展望 | 第38-39页 |
| 主要结论 | 第38页 |
| 展望 | 第38-39页 |
| 致谢 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-43页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第43页 |
