| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-19页 |
| 1.1 红球菌属 | 第11-12页 |
| 1.2 2-苯基丙酸 | 第12-13页 |
| 1.3 P450单加氧酶 | 第13-15页 |
| 1.3.1 细胞色素P450单加氧酶命名 | 第13页 |
| 1.3.2 细胞色素P450酶系催化反应类型 | 第13页 |
| 1.3.3 P450酶的分类 | 第13-14页 |
| 1.3.4 P450酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.4 包涵体 | 第15页 |
| 1.5 优化过程 | 第15-17页 |
| 1.5.1 单因素实验 | 第15-16页 |
| 1.5.2 PB实验(Plackett-Burman design) | 第16页 |
| 1.5.3 最陡爬坡实验(method of steepest ascent) | 第16-17页 |
| 1.5.4 中心组合实验设计(CCD) | 第17页 |
| 1.5.5 实验验证 | 第17页 |
| 1.6 2-苯基丙酸研究现状 | 第17-18页 |
| 1.7 本课题研究意义 | 第18页 |
| 1.8 主要研究内容 | 第18-19页 |
| 第二章 烷烃降解菌Rhodococcus sp.G2代谢特性研究 | 第19-29页 |
| 2.1 前言 | 第19页 |
| 2.2 实验材料 | 第19-21页 |
| 2.2.1 菌株 | 第19页 |
| 2.2.2 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第20页 |
| 2.2.4 实验溶液的配制 | 第20-21页 |
| 2.3 实验方法 | 第21-23页 |
| 2.3.1 摇瓶实验 | 第21页 |
| 2.3.2 5L罐发酵实验 | 第21页 |
| 2.3.3 菌体浓度测定 | 第21页 |
| 2.3.4 微生物共代谢过程中各物质的分析测定 | 第21-23页 |
| 2.4 结果讨论 | 第23-28页 |
| 2.4.1 Rhodococcus sp.G2以7.5g/L正十二烷为唯一碳源摇瓶培养 | 第23页 |
| 2.4.2 Rhodococcus sp.G2以6.8g/L葡萄糖为唯一碳源摇瓶培养 | 第23-24页 |
| 2.4.3 Rhodococcus sp.G2在正十二烷和葡萄糖同时存在条件下摇瓶培养 | 第24-25页 |
| 2.4.4 不同葡萄糖浓度下Rhodococcus sp.G2的摇瓶培养 | 第25页 |
| 2.4.5 不同正十二烷浓度下的Rhodococcus sp.G2摇瓶培养 | 第25-27页 |
| 2.4.6 正十二烷为1.5g/L葡萄糖为6.8g/L时Rhodococcus sp.G2摇瓶培养 | 第27页 |
| 2.4.7 十二烷为1.5g/L葡萄糖为6.8g/L时Rhodococcus sp.G2 5L罐培养 | 第27-28页 |
| 2.5 本章小结 | 第28-29页 |
| 第三章 Rhodococcus sp.G14生产2-苯基丙酸的研究 | 第29-40页 |
| 3.1 引言 | 第29页 |
| 3.2 实验材料 | 第29-30页 |
| 3.2.1 菌株 | 第29页 |
| 3.2.2 主要仪器设备 | 第29页 |
| 3.2.3 主要材料试剂 | 第29-30页 |
| 3.3 实验方法 | 第30-32页 |
| 3.3.1 菌种活化 | 第30页 |
| 3.3.2 细胞催化反应 | 第30页 |
| 3.3.3 HPLC检测2-苯基丙酸,2-苯基-1-丙醇 | 第30-32页 |
| 3.3.4 GC检测异丙苯 | 第32页 |
| 3.3.5 GC-MS检测氧化产物 | 第32页 |
| 3.4 结果讨论 | 第32-39页 |
| 3.4.1 氧化产物GC-MS鉴定 | 第32-33页 |
| 3.4.2 正十二烷浓度对菌体生长的影响 | 第33-34页 |
| 3.4.3 吐温80对菌体生长的影响 | 第34页 |
| 3.4.4 氮源对菌体生长的影响 | 第34-35页 |
| 3.4.5 培养基优化前后对2-苯基丙酸产量的影响 | 第35页 |
| 3.4.6 样品pH对HPLC检测2-苯基丙酸的影响 | 第35-36页 |
| 3.4.7 反应时间对细胞催化反应的影响 | 第36页 |
| 3.4.8 反应温度对催化反应的影响 | 第36-37页 |
| 3.4.9 菌体浓度OD_(600)对氧化反应的影响 | 第37页 |
| 3.4.10 底物浓度对催化反应的影响 | 第37-38页 |
| 3.4.11 渗透剂处理细胞后催化反应 | 第38-39页 |
| 3.4.12 500ml反应器的放大实验 | 第39页 |
| 3.4.13 异丙苯的留向 | 第39页 |
| 3.5 本章小结 | 第39-40页 |
| 第四章 基因工程菌的构建及2-苯基丙酸的生物转化 | 第40-58页 |
| 4.1 引言 | 第40页 |
| 4.2 实验材料 | 第40-43页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第40页 |
| 4.2.2 仪器设备 | 第40页 |
| 4.2.3 主要材料,试剂 | 第40-41页 |
| 4.2.4 实验溶液的配制 | 第41-43页 |
| 4.3 实验方法 | 第43-49页 |
| 4.3.1 目的片段P450基因的PCR扩增 | 第43-44页 |
| 4.3.2 目的片段与T载体的连接 | 第44页 |
| 4.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| 4.3.4 大肠杆菌转化实验 | 第45页 |
| 4.3.5 蓝白斑筛选 | 第45-46页 |
| 4.3.6 重组质粒的抽提 | 第46页 |
| 4.3.7 菌落PCR验证和双酶切验证 | 第46页 |
| 4.3.8 重组质粒pET28a-P450、pET43.1a-P450的构建及转化 | 第46-47页 |
| 4.3.9 重组大肠杆菌BL21/pET28a-P450、BL21/pET43.1a-P450的诱导表达 | 第47-48页 |
| 4.3.10 重组大肠杆菌表达目的蛋白是否为包涵体的鉴定 | 第48页 |
| 4.3.11 减少细胞中蛋白电泳包涵体的方法 | 第48页 |
| 4.3.12 E.coli BL21/pET28a-P450中粗酶液的催化反应 | 第48-49页 |
| 4.3.13 两株重组大肠杆菌氧化异丙苯产物鉴定及比较 | 第49页 |
| 4.4 结果讨论 | 第49-57页 |
| 4.4.1 基因组抽提及目的基因P450扩增 | 第49-50页 |
| 4.4.2 目的基因与T载体的连接与转化 | 第50-51页 |
| 4.4.3 目的基因与载体pET28a和pET43.1a的连接与转化 | 第51-52页 |
| 4.4.4 重组表达菌株的鉴定 | 第52-53页 |
| 4.4.5 重组菌目的蛋白的表达 | 第53-55页 |
| 4.4.6 E.coli BL21/pET28a-P450中粗酶液的催化反应 | 第55页 |
| 4.4.7 E.coli BL21/pET28a-P450全细胞氧化反应 | 第55-56页 |
| 4.4.8 氧化产物的鉴定 | 第56-57页 |
| 4.4.9 两株重组菌氧化能力比较 | 第57页 |
| 4.5 本章小结 | 第57-58页 |
| 第五章 重组菌E.coli BL21/pET43.1a-P450的催化反应优化 | 第58-66页 |
| 5.1 引言 | 第58页 |
| 5.2 实验材料 | 第58页 |
| 5.2.1 菌株 | 第58页 |
| 5.3 实验方法 | 第58-59页 |
| 5.3.1 细胞催化反应 | 第58页 |
| 5.3.2 优化方法 | 第58-59页 |
| 5.4 结果讨论 | 第59-65页 |
| 5.4.1 PB实验 | 第59-61页 |
| 5.4.2 爬坡实验 | 第61-62页 |
| 5.4.3 CCD实验 | 第62-65页 |
| 5.4.4 实验验证 | 第65页 |
| 5.5 本章小结 | 第65-66页 |
| 第六章 结论与展望 | 第66-67页 |
| 6.1 结论 | 第66页 |
| 6.2 展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
