| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 1 综述 | 第13-23页 |
| 1.1 凝乳酶研究进展 | 第13-18页 |
| 1.1.1 凝乳酶来源多样性 | 第13-16页 |
| 1.1.2 牛凝乳酶分子特性及凝乳机理 | 第16-18页 |
| 1.2 乳酸克鲁维酵母表达系统 | 第18-21页 |
| 1.2.1 乳酸克鲁维酵母表达系统优点 | 第18页 |
| 1.2.2 乳酸克鲁维酵母表达载体 | 第18-19页 |
| 1.2.3 高效表达外源蛋白策略 | 第19-21页 |
| 1.3 本研究的内容与意义 | 第21-23页 |
| 1.3.1 研究内容 | 第21-22页 |
| 1.3.2 意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 表达载体与菌株 | 第23页 |
| 2.1.2 主要工具酶与试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第24页 |
| 2.1.4 主要培养基及配方 | 第24-25页 |
| 2.1.5 主要缓冲液及其组成 | 第25页 |
| 2.1.6 PCR引物 | 第25页 |
| 2.1.7 蛋白质电泳试剂 | 第25页 |
| 2.2 牛凝乳酶原基因表达 | 第25-30页 |
| 2.2.1 牛凝乳酶原基因合成 | 第25-26页 |
| 2.2.2 重组质粒Bchymo290-1的构建 | 第26页 |
| 2.2.3 线性化重组质粒制备 | 第26页 |
| 2.2.4 Klactis GG799感受态制备 | 第26-27页 |
| 2.2.5 电转化K. lactis GG799 | 第27页 |
| 2.2.6 重组子筛选 | 第27页 |
| 2.2.7 多拷贝重组酵母菌株的筛选及PCR鉴定 | 第27-29页 |
| 2.2.8 酶活性的测定 | 第29页 |
| 2.2.9 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第29-30页 |
| 2.3 发酵培养基优化 | 第30-32页 |
| 2.3.1 Plackett-Burman设计 | 第30-31页 |
| 2.3.2 最陡爬坡实验 | 第31页 |
| 2.3.3 Box-Behnken设计 | 第31页 |
| 2.3.4 模型验证 | 第31-32页 |
| 2.4 重组菌株发酵工艺优化与5L发酵罐高密度发酵 | 第32-34页 |
| 2.4.1 1L四联体发酵罐发酵培养 | 第32页 |
| 2.4.2 菌体浓度的测定 | 第32页 |
| 2.4.3 还原糖测定 | 第32-33页 |
| 2.4.4 pH对重组乳酸克鲁维酵母发酵的影响 | 第33页 |
| 2.4.5 溶氧浓度对重组乳酸克鲁维酵母发酵的影响 | 第33页 |
| 2.4.6 5L发酵罐高密度发酵 | 第33-34页 |
| 2.5 粗酶制剂的制取与活性测定 | 第34-36页 |
| 2.5.1 粗酶液制备 | 第34页 |
| 2.5.2 超滤法纯化 | 第34-35页 |
| 2.5.3 SDS-PAGE凝胶电泳检测 | 第35页 |
| 2.5.4 粗酶制剂活性测定 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-52页 |
| 3.1 牛凝乳酶原基因的合成 | 第36页 |
| 3.2 表达载体Bchymo290-1的构建 | 第36-38页 |
| 3.3 重组菌株构建、筛选及多拷贝整合重组菌株的鉴定 | 第38-39页 |
| 3.4 重组菌株生物量及产酶活性测定 | 第39-40页 |
| 3.5 重组菌株表达产物的SDS-PAGE电泳分析 | 第40-41页 |
| 3.6 Plackett-Burman实验 | 第41-42页 |
| 3.7 最陡爬坡实验 | 第42-43页 |
| 3.8 Box-Behnken设计优化培养基 | 第43-46页 |
| 3.9 回归模型验证 | 第46页 |
| 3.10 不同pH对发酵产牛凝乳酶的影响 | 第46-48页 |
| 3.11 不同DO值对发酵产牛凝乳酶的影响 | 第48-49页 |
| 3.12 5L发酵系统发酵产重组牛凝乳酶 | 第49-50页 |
| 3.13 粗酶制剂的制取与活性测定 | 第50-52页 |
| 4 结论与讨论 | 第52-57页 |
| 4.1 结论 | 第52-53页 |
| 4.1.1 高效表达重组牛凝乳酶工程菌株的构建及筛选 | 第52页 |
| 4.1.2 重组菌株发酵培养基优化 | 第52页 |
| 4.1.3 重组菌株发酵工艺条件的优化及高密度发酵 | 第52-53页 |
| 4.1.4 重组牛凝乳酶的纯化及粗酶制剂的制取 | 第53页 |
| 4.2 讨论 | 第53-55页 |
| 4.3 创新点与展望 | 第55-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 附录 | 第63-64页 |
| 攻读学位期间获得的科研成果 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
