| 目录 | 第5-11页 |
| 致谢 | 第11-12页 |
| 英文缩略词(ABBREVIATION) | 第12-14页 |
| 摘要 | 第14-16页 |
| Abstract | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-44页 |
| 1.1 少动鞘氨醇单胞菌产结冷胶的研究进展 | 第19-38页 |
| 1.1.1 结冷胶的结构 | 第20页 |
| 1.1.2 结冷胶的特性 | 第20-22页 |
| 1.1.2.1 稳定性好 | 第20-21页 |
| 1.1.2.2 高凝胶强度和透明度 | 第21页 |
| 1.1.2.3 温度滞后性 | 第21页 |
| 1.1.2.4 假塑性和流变性 | 第21-22页 |
| 1.1.2.5 良好的配伍性 | 第22页 |
| 1.1.2.6 熔点、凝固点、弹性、脆性、凝胶强度可以调节 | 第22页 |
| 1.1.2.7 优越的呈味性能和风味释放性 | 第22页 |
| 1.1.3 结冷胶的凝胶形成机制 | 第22-23页 |
| 1.1.4 影响结冷胶凝胶特性的因素 | 第23-25页 |
| 1.1.4.1 酰基含量 | 第24页 |
| 1.1.4.2 阳离子的类型和浓度 | 第24页 |
| 1.1.4.3 结冷胶浓度 | 第24-25页 |
| 1.1.4.4 pH值 | 第25页 |
| 1.1.4.5 亲水性成分 | 第25页 |
| 1.1.5 结冷胶的生物合成途径 | 第25-30页 |
| 1.1.5.1 糖核苷酸前体的合成 | 第26-27页 |
| 1.1.5.2 四糖重复单元的组装 | 第27-28页 |
| 1.1.5.3 四糖重复单元的聚合及结冷胶的分泌 | 第28-29页 |
| 1.1.5.4 结冷胶生物合成基因簇中功能未知的基因 | 第29-30页 |
| 1.1.6 结冷胶的发酵 | 第30-33页 |
| 1.1.6.1 菌种筛选 | 第30页 |
| 1.1.6.2 发酵工艺优化 | 第30-33页 |
| 1.1.7 结冷胶合成的代谢调控优化 | 第33-36页 |
| 1.1.7.1 对糖的分解代谢的改造 | 第34页 |
| 1.1.7.2 对结冷胶生物合成途径的改造 | 第34-36页 |
| 1.1.7.3 其它相关的基因工程改造 | 第36页 |
| 1.1.8 结冷胶的提取和纯化 | 第36-37页 |
| 1.1.9 结冷胶的应用 | 第37-38页 |
| 1.2 类胡萝卜素的结构、功能及生物合成途径 | 第38-41页 |
| 1.2.1 类胡萝卜素的结构 | 第38-39页 |
| 1.2.2 类胡萝卜素的功能 | 第39-40页 |
| 1.2.3 类胡萝卜素的生物合成途径 | 第40-41页 |
| 1.3 研究目的与研究内容 | 第41-44页 |
| 第二章 结冷胶生产菌株的诱变选育 | 第44-70页 |
| 2.1 前言 | 第44页 |
| 2.2 材料 | 第44-48页 |
| 2.2.1 菌株 | 第44-45页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第45页 |
| 2.2.3 培养基与实验试剂的配制 | 第45-47页 |
| 2.2.3.1 YPG液体培养基 | 第45页 |
| 2.2.3.2 YPG固体培养基 | 第45页 |
| 2.2.3.3 种子培养基 | 第45-46页 |
| 2.2.3.4 摇瓶发酵培养基 | 第46页 |
| 2.2.3.5 发酵罐发酵培养基 | 第46页 |
| 2.2.3.6 发酵液残糖含量测定所需试剂 | 第46页 |
| 2.2.3.7 葡萄糖醛酸含量测定所需试剂 | 第46-47页 |
| 2.2.3.8 乙酰基含量测定所需试剂 | 第47页 |
| 2.2.3.9 结冷胶相对分子量测定所需试剂 | 第47页 |
| 2.2.3.10 发酵液丙酮酸含量测定所需试剂 | 第47页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第47-48页 |
| 2.3 方法 | 第48-60页 |
| 2.3.1 菌株诱变 | 第48-49页 |
| 2.3.2 结冷胶发酵流程 | 第49页 |
| 2.3.2.1 摇瓶发酵 | 第49页 |
| 2.3.2.2 罐上发酵 | 第49页 |
| 2.3.3 发酵液稳定性检测 | 第49-50页 |
| 2.3.4 乙酰基转移酶基因及其侧翼序列的分析 | 第50-55页 |
| 2.3.4.1 少动鞘氨醇单胞菌基因组DNA的提取 | 第50页 |
| 2.3.4.2 PCR扩增乙酰基转移酶基因 | 第50-51页 |
| 2.3.4.3 SiteFinding-PCR方法获得乙酰基转移酶基因侧翼序列 | 第51-54页 |
| 2.3.4.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第54页 |
| 2.3.4.5 目的条带割胶回收后测序 | 第54-55页 |
| 2.3.5 结冷胶发酵分析 | 第55-60页 |
| 2.3.5.1 结冷胶产量测定 | 第55页 |
| 2.3.5.2 发酵液粘度测定 | 第55页 |
| 2.3.5.3 发酵液残糖含量测定 | 第55-57页 |
| 2.3.5.4 结冷胶分析样品的制备 | 第57页 |
| 2.3.5.5 葡萄糖、鼠李糖、甘油酰基含量测定 | 第57页 |
| 2.3.5.6 葡萄糖醛酸含量测定 | 第57-58页 |
| 2.3.5.7 酰基含量测定 | 第58页 |
| 2.3.5.8 结冷胶相对分子量测定 | 第58-59页 |
| 2.3.5.9 发酵液类胡萝卜素含量测定 | 第59页 |
| 2.3.5.10 发酵液丙酮酸含量测定 | 第59-60页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第60-68页 |
| 2.4.1 诱变选育 | 第60-61页 |
| 2.4.2 罐上发酵性能的测定 | 第61-62页 |
| 2.4.3 结冷胶的组分和分子量分析 | 第62-64页 |
| 2.4.4 发酵液中类胡萝卜素含量和丙酮酸含量分析 | 第64-66页 |
| 2.4.5 乙酰基转移酶基因及其侧翼序列的分析 | 第66-67页 |
| 2.4.6 发酵液稳定性检测 | 第67-68页 |
| 2.5 本章小结 | 第68-70页 |
| 第三章 基因敲除方法构建黄色素生成缺陷的少动鞘氨醇单胞菌 | 第70-94页 |
| 3.1 前言 | 第70-71页 |
| 3.2 材料 | 第71-75页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第71-72页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第72页 |
| 3.2.3 培养基的配制 | 第72-73页 |
| 3.2.3.1 YPG液体培养基 | 第72页 |
| 3.2.3.2 YPG固体培养基 | 第72-73页 |
| 3.2.3.3 LB液体培养基 | 第73页 |
| 3.2.3.4 LB固体培养基 | 第73页 |
| 3.2.3.5 预培养培养基 | 第73页 |
| 3.2.3.6 8%蔗糖平板筛选培养基 | 第73页 |
| 3.2.3.7 YM固体培养基 | 第73页 |
| 3.2.3.8 发酵培养基 | 第73页 |
| 3.2.4 主要仪器 | 第73-75页 |
| 3.3 方法 | 第75-87页 |
| 3.3.1 八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)的克隆 | 第75-79页 |
| 3.3.1.1 少动鞘氨醇单胞菌基因组DNA的提取 | 第75页 |
| 3.3.1.2 简并引物PCR扩增 | 第75-76页 |
| 3.3.1.3 目的条带与T载体的连接 | 第76-77页 |
| 3.3.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第77页 |
| 3.3.1.5 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第77页 |
| 3.3.1.6 菌落PCR挑选转化子 | 第77-78页 |
| 3.3.1.7 SiteFinding-PCR方法克隆八氢番茄红素脱氢酶基因及其侧翼序列 | 第78-79页 |
| 3.3.2 crtI基因敲除质粒的构建 | 第79-82页 |
| 3.3.2.1 质粒DNA小量提取 | 第79-80页 |
| 3.3.2.2 PCR扩增crtI基因上下游片段 | 第80-81页 |
| 3.3.2.3 crtI基因上游片段限制性内切酶酶切 | 第81页 |
| 3.3.2.5 DNA连接 | 第81-82页 |
| 3.3.2.6 连接产物转化大肠杆菌S17-1感受态细胞 | 第82页 |
| 3.3.2.7 阳性克隆的筛选和鉴定 | 第82页 |
| 3.3.2.8 pLO3-I重组质粒的构建 | 第82页 |
| 3.3.3 △crtI重组菌株的构建 | 第82-86页 |
| 3.3.3.1 三亲接合 | 第82-83页 |
| 3.3.3.2 重组子的筛选 | 第83-86页 |
| 3.3.4 结冷胶发酵 | 第86页 |
| 3.3.5 类胡萝卜素的提取和鉴定 | 第86-87页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第87-93页 |
| 3.4.1 crtI基因序列分析 | 第87-88页 |
| 3.4.2 △crtI重组菌株的表型 | 第88-89页 |
| 3.4.3 类胡萝卜素的分离和鉴定 | 第89-91页 |
| 3.4.4 发酵性能的测定 | 第91-93页 |
| 3.5 本章小结 | 第93-94页 |
| 第四章 黄色素生成缺陷的少动鞘氨醇单胞菌产结冷胶提取工艺的优化 | 第94-100页 |
| 4.1 前言 | 第94页 |
| 4.2 材料 | 第94-96页 |
| 4.2.1 菌株 | 第94-95页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第95页 |
| 4.2.3 培养基与实验试剂的配制 | 第95-96页 |
| 4.2.3.1 YPG液体培养基 | 第95页 |
| 4.2.3.2 YPG固体培养基 | 第95页 |
| 4.2.3.3 种子培养基 | 第95页 |
| 4.2.3.4 发酵罐发酵培养基 | 第95页 |
| 4.2.3.5 结冷胶的提取和纯化所需试剂 | 第95-96页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第96页 |
| 4.3 方法 | 第96-97页 |
| 4.3.1 结冷胶发酵 | 第96页 |
| 4.3.2 结冷胶的提取和纯化 | 第96-97页 |
| 4.3.3 制备的结冷胶成品中类胡萝卜素含量的测定 | 第97页 |
| 4.3.3.1 野生型菌株发酵制备的结冷胶成品 | 第97页 |
| 4.3.3.2 △crtI3发酵制备的结冷胶成品 | 第97页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第97-99页 |
| 4.4.1 两种提取方法效果的比较 | 第97-99页 |
| 4.5 本章小结 | 第99-100页 |
| 第五章 少动鞘氨醇单胞菌类胡萝卜素合成途径的研究 | 第100-128页 |
| 5.1 前言 | 第100-101页 |
| 5.2 材料 | 第101-105页 |
| 5.2.1 菌株与质粒 | 第101-102页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第102-103页 |
| 5.2.3 培养基与实验试剂的配制 | 第103-104页 |
| 5.2.3.1 YPG液体培养基 | 第103页 |
| 5.2.3.2 YPG固体培养基 | 第103页 |
| 5.2.3.3 LB液体培养基 | 第103页 |
| 5.2.3.4 LB固体培养基 | 第103页 |
| 5.2.3.5 YG培养基 | 第103-104页 |
| 5.2.3.6 预培养培养基 | 第104页 |
| 5.2.3.7 8%蔗糖平板筛选培养基 | 第104页 |
| 5.2.3.8 YM固体培养基 | 第104页 |
| 5.2.3.9 crtG基因诱导表达时IPTG的配制 | 第104页 |
| 5.2.4 主要仪器 | 第104-105页 |
| 5.3 方法 | 第105-116页 |
| 5.3.1 类胡萝卜素合成相关基因的克隆 | 第105-108页 |
| 5.3.1.1 少动鞘氨醇单胞菌基因组DNA的提取 | 第105页 |
| 5.3.1.2 类胡萝卜素生物合成基因簇的克隆 | 第105页 |
| 5.3.1.3 crtZ基因(β-胡萝卜素羟化酶基因)的克隆 | 第105-108页 |
| 5.3.2 序列分析和进化树构建 | 第108页 |
| 5.3.3 基因缺失菌株的构建 | 第108-110页 |
| 5.3.3.1 基因敲除质粒的构建 | 第108页 |
| 5.3.3.2 三亲接合及重组子的筛选 | 第108-110页 |
| 5.3.4 crtZ基因表达载体pACCAR16AcrtX-Z的构建 | 第110-113页 |
| 5.3.4.1 PCR扩增crtZ基因、Pantoea ananatis crtE基因 | 第110-112页 |
| 5.3.4.2 限制性内切酶酶切 | 第112页 |
| 5.3.4.3 DNA连接 | 第112-113页 |
| 5.3.4.4 连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞 | 第113页 |
| 5.3.4.5 阳性克隆的筛选和鉴定 | 第113页 |
| 5.3.5 crtG基因表达载体pUC18G的构建 | 第113-115页 |
| 5.3.5.1 PCR扩增crtG基因 | 第113-114页 |
| 5.3.5.2 crtG基因片段、pUC18质粒限制性内切酶酶切 | 第114-115页 |
| 5.3.5.3 DNA连接 | 第115页 |
| 5.3.5.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第115页 |
| 5.3.5.5 阳性克隆的筛选和鉴定 | 第115页 |
| 5.3.6 类胡萝卜素的提取和鉴定 | 第115-116页 |
| 5.3.6.1 少动鞘氨醇单胞菌菌体培养 | 第115-116页 |
| 5.3.6.2 大肠杆菌菌体培养 | 第116页 |
| 5.3.6.3 类胡萝卜素的分离和鉴定 | 第116页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第116-126页 |
| 5.4.1 类胡萝卜素合成相关基因的克隆 | 第116-117页 |
| 5.4.2 类胡萝卜素合成相关基因的序列分析 | 第117-121页 |
| 5.4.3 基因缺失菌株所产类胡萝卜素的鉴定 | 第121-123页 |
| 5.4.4 crtZ、crtG基因在大肠杆菌中的表达 | 第123-126页 |
| 5.5 本章小结 | 第126-128页 |
| 第六章 全文总结及后续工作建议 | 第128-132页 |
| 6.1 全文总结 | 第128-130页 |
| 6.2 本文创新点 | 第130-131页 |
| 6.3 后续工作建议 | 第131-132页 |
| 参考文献 | 第132-145页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第145-146页 |
