| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1 果酒 | 第14-16页 |
| 1.1 果酒的定义以及其发展概况 | 第14页 |
| 1.2 果酒的降酸方法 | 第14-16页 |
| 1.2.1 物理降酸法 | 第14-15页 |
| 1.2.2 化学降酸法 | 第15页 |
| 1.2.3 生物降酸法 | 第15-16页 |
| 2 苹果酸-乳酸发酵概述 | 第16-19页 |
| 2.1 苹果酸-乳酸发酵 | 第16页 |
| 2.2 苹果酸-乳酸发酵的代谢调控 | 第16-17页 |
| 2.3 苹果酸-乳酸酶的酶学性质 | 第17-18页 |
| 2.4 苹果酸-乳酸酶的基因结构 | 第18页 |
| 2.5 苹果酸-乳酸发酵其他相关酶及其特性 | 第18-19页 |
| 3 苹果酸-乳酸酶的分子生物学研究 | 第19-20页 |
| 4 酶的定向进化 | 第20-24页 |
| 4.1 酶的定向进化策略 | 第20-21页 |
| 4.2 常用定向进化技术 | 第21-24页 |
| 4.2.1 易错PCR | 第21页 |
| 4.2.2 DNA改组(DNA Shuffling) | 第21-22页 |
| 4.2.3 交错延伸技术 | 第22-24页 |
| 5 产乳酸菌株的筛选 | 第24-26页 |
| 5.1 高效筛选技术 | 第24页 |
| 5.2 产乳酸菌株的筛选方法研究 | 第24-26页 |
| 5.2.1 透明圈筛选法 | 第24-25页 |
| 5.2.2 基于pH指示剂的筛选方法 | 第25页 |
| 5.2.3 基于L-乳酸脱氢酶的筛选方法 | 第25-26页 |
| 6 实验技术路线 | 第26页 |
| 7 研究内容、目的和意义 | 第26-28页 |
| 7.1 实验内容 | 第26-27页 |
| 7.2 实验目的及意义 | 第27-28页 |
| 第二章 苹果酸-乳酸酶的酶学性质研究 | 第28-46页 |
| 1 材料与方法 | 第28-29页 |
| 1.1 材料 | 第28-29页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第28-29页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第29页 |
| 1.1.3 培养基 | 第29页 |
| 1.1.4 主要仪器与设备 | 第29页 |
| 2 方法 | 第29-35页 |
| 2.1 试剂配制 | 第29-30页 |
| 2.2 酵母质粒提取 | 第30页 |
| 2.3 质粒pADH1-mle的PCR验证 | 第30-31页 |
| 2.3.1 mle基因引物的设计 | 第30-31页 |
| 2.3.2 信号肽基因引物的设计 | 第31页 |
| 2.3.3 α -凝集素锚定基因引物的设计 | 第31页 |
| 2.4 PCR产物的检测 | 第31-32页 |
| 2.5 Fm5的形态观察 | 第32页 |
| 2.5.1 相差显微镜观察 | 第32页 |
| 2.5.2 扫描电子显微镜观察 | 第32页 |
| 2.6 苹果酸-乳酸酶的酶活定义 | 第32-33页 |
| 2.7 活细胞计数 | 第33页 |
| 2.8 Fm5的生长状况观察和产酶状况检测 | 第33页 |
| 2.8.1 Fm5生长状况观察 | 第33页 |
| 2.8.2 Fm5产酶状况检测 | 第33页 |
| 2.9 苹果酸-乳酸酶反应体系的制备 | 第33-34页 |
| 2.10 苹果酸-乳酸酶的酶学性质研究 | 第34-35页 |
| 2.10.1 苹果酸-乳酸酶的最适NAD~+浓度 | 第34页 |
| 2.10.2 苹果酸-乳酸酶的最适Mn~(2+)浓度 | 第34页 |
| 2.10.3 苹果酸-乳酸酶的最适pH和pH稳定性 | 第34页 |
| 2.10.4 苹果酸-乳酸酶的最适温度和温度稳定性 | 第34-35页 |
| 2.10.5 金属阳离子对苹果酸-乳酸酶水解活性的影响 | 第35页 |
| 2.11 苹果酸-乳酸酶水解活性检测方法 | 第35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-44页 |
| 3.1 Fm5中所含质粒的pADH1-mle的PCR验证 | 第35-36页 |
| 3.2 Fm5的形态观察 | 第36-38页 |
| 3.2.1 相差显微镜观察 | 第36-37页 |
| 3.2.2 扫描电子显微镜观察 | 第37-38页 |
| 3.3 苹果酸-乳酸酶的酶学性质研究 | 第38-44页 |
| 3.3.1 表面展示MLE酿酒酵母的生长状况观察以及产酶状况检测 | 第38-39页 |
| 3.3.2 NAD~+浓度苹果酸-乳酸酶水解活性的影响 | 第39-40页 |
| 3.3.3 Mn~(2+)浓度对苹果酸-乳酸酶水解活性的影响 | 第40-41页 |
| 3.3.4 苹果酸-乳酸酶反应的最适pH | 第41页 |
| 3.3.5 苹果酸-乳酸酶的pH稳定性 | 第41-42页 |
| 3.3.6 苹果酸-乳酸酶的最适反应温度 | 第42-43页 |
| 3.3.7 苹果酸-乳酸酶的热稳定性 | 第43页 |
| 3.3.8 不同金属阳离子对苹果酸-乳酸酶的水解活性的影响 | 第43-44页 |
| 4 小结与讨论 | 第44-46页 |
| 4.1 小结 | 第44-45页 |
| 4.2 讨论 | 第45-46页 |
| 第三章 高效筛选耐酸苹果酸-乳酸酶方法的建立 | 第46-58页 |
| 1 材料 | 第47-48页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第47页 |
| 1.2 主要试剂 | 第47页 |
| 1.3 培养基 | 第47页 |
| 1.4 主要仪器与设备 | 第47-48页 |
| 2 方法 | 第48-52页 |
| 2.1 试剂的配制 | 第48-49页 |
| 2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第49页 |
| 2.3 含重组质粒pET28a(+)-mle的大肠杆菌的验证 | 第49-51页 |
| 2.3.1 mle基因引物设计 | 第49页 |
| 2.3.2 信号肽基因引物设计 | 第49-50页 |
| 2.3.3 重组质粒pET28a(+)-mle的PCR验证 | 第50页 |
| 2.3.4 重组质粒pET28a(+)-mle的酶切验证 | 第50-51页 |
| 2.4 高效筛选耐酸苹果酸-乳酸酶筛选方法的建立 | 第51-52页 |
| 2.4.1 含pET28a(+)-mle的重组大肠杆菌BL21诱导表达苹果酸-乳酸酶及降酸反应 | 第51页 |
| 2.4.2 苹果酸-乳酸酶的诱导表达和酸环境处理后降酸反应 | 第51-52页 |
| 2.4.3 吩嗪二甲酯硫酸盐-氯化硝基四氮唑蓝(PMS-NBT)显色反应 | 第52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-57页 |
| 3.1 含重组表达载体pET28a(+)-mle的大肠杆菌的验证 | 第52-54页 |
| 3.1.1 重组表达载体pET28a(+)-mle的质粒PCR验证 | 第52-53页 |
| 3.1.2 重组质粒pET28a(+)-mle的酶切验证 | 第53-54页 |
| 3.2 高效筛选耐酸苹果酸-乳酸酶方法的建立 | 第54-57页 |
| 3.2.1 高效筛选耐酸苹果酸-乳酸酶流程图 | 第54-55页 |
| 3.2.2 PMS-NBT显色系统的验证 | 第55-56页 |
| 3.2.3 PMS-NBT显色高效筛选法建立 | 第56-57页 |
| 4 小结与讨论 | 第57-58页 |
| 4.1 小结 | 第57页 |
| 4.2 讨论 | 第57-58页 |
| 第四章 苹果酸-乳酸酶耐酸性定向进化 | 第58-74页 |
| 1 材料 | 第59-60页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第59页 |
| 1.2 主要试剂 | 第59页 |
| 1.3 培养基 | 第59页 |
| 1.4 主要仪器与设备 | 第59-60页 |
| 2 方法 | 第60-68页 |
| 2.1 试剂的配制 | 第60页 |
| 2.2 枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第60-61页 |
| 2.3 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第61页 |
| 2.4 第一轮易错PCR扩增mle基因 | 第61-62页 |
| 2.5 第二轮易错PCR扩增mle基因 | 第62页 |
| 2.6 信号肽基因的克隆 | 第62-63页 |
| 2.7 信号肽基因和突变mle基因的融合PCR | 第63-64页 |
| 2.8 突变库的构建 | 第64-65页 |
| 2.8.1 含突变基因质粒文库的构建 | 第64-65页 |
| 2.8.2 大肠杆菌的转化 | 第65页 |
| 2.9 含突变基因表达文库的构建 | 第65-66页 |
| 2.9.1 含突变基因的重组质粒的抽提 | 第65-66页 |
| 2.9.2 大肠杆菌BL21感受态细胞的制备 | 第66页 |
| 2.9.3 重组质粒pET28a(+)-mle转化大肠杆菌BL21感受态细胞 | 第66页 |
| 2.10 突变文库的筛选 | 第66-68页 |
| 2.10.1 通用引物的设计 | 第66页 |
| 2.10.2 重组大肠杆菌转化子的筛选与鉴定 | 第66-67页 |
| 2.10.3 耐酸性苹果酸-乳酸酶的高效筛选 | 第67页 |
| 2.10.4 耐酸性MLE的耐酸鉴定 | 第67-68页 |
| 2.10.5 耐酸性mle基因的序列分析 | 第68页 |
| 3 结论与分析 | 第68-73页 |
| 3.1 mle基因的易错PCR扩增 | 第68-69页 |
| 3.2 信号肽基因的PCR扩增 | 第69页 |
| 3.3 mle基因和信号肽基因的融合PCR | 第69-70页 |
| 3.4 含重组质粒pET28a(+)-mle的大肠杆菌转化子的菌落PCR验证 | 第70-71页 |
| 3.5 第一轮耐酸性苹果酸-乳酸酶的高效筛选 | 第71页 |
| 3.6 第二轮耐酸性MLE高效筛选 | 第71-72页 |
| 3.7 耐酸性苹果酸-乳酸酶的耐酸鉴定 | 第72页 |
| 3.8 突变mle基因的序列及其编码氨基酸序列对比 | 第72-73页 |
| 4 小结与讨论 | 第73-74页 |
| 4.1 小结 | 第73页 |
| 4.2 讨论 | 第73-74页 |
| 第五章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 1 结论 | 第74-75页 |
| 1.1 苹果酸-乳酸酶的酶学性质研究 | 第74页 |
| 1.2 高效筛选耐酸性苹果酸-乳酸酶方法的建立 | 第74页 |
| 1.3 耐酸性苹果酸-乳酸酶的定向进化 | 第74-75页 |
| 2 展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 附录1 突变mle基因序列比对 | 第80-83页 |
| 附录2 突变mle基因编码氨基酸序列比对 | 第83-84页 |
