| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第9-14页 |
| 1.1 磷脂酶B简介 | 第9-10页 |
| 1.1.1 磷脂酶B的制备 | 第9页 |
| 1.1.2 磷脂酶B的应用 | 第9-10页 |
| 1.2 P.pastoris表达系统 | 第10-12页 |
| 1.2.1 P.pastoris表达系统简介 | 第10-11页 |
| 1.2.2 P.pastoris发酵优化策略 | 第11页 |
| 1.2.3 P.pastoris共表达伴侣蛋白策略 | 第11-12页 |
| 1.3 立题依据及意义 | 第12页 |
| 1.4 本论文主要研究内容 | 第12-14页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第14-24页 |
| 2.1 实验材料 | 第14-15页 |
| 2.1.1 实验菌种与质粒 | 第14页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第14页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第14-15页 |
| 2.1.4 培养基 | 第15页 |
| 2.2 菌株培养方法 | 第15-16页 |
| 2.2.1 E.coli JM109的培养 | 第15-16页 |
| 2.2.2 重组P.pastoris的摇瓶培养和诱导产酶 | 第16页 |
| 2.2.3 重组P.pastoris的 3.6 L发酵罐培养和诱导产酶 | 第16页 |
| 2.3 分子生物学操作 | 第16-20页 |
| 2.3.1 密码子优化 | 第16页 |
| 2.3.2 E.coli JM109感受态细胞的制备 | 第16-17页 |
| 2.3.3 E.coli JM109感受态细胞的热激转化 | 第17页 |
| 2.3.4 E.coli JM109质粒提取 | 第17页 |
| 2.3.5 核酸琼脂糖凝胶电泳 | 第17页 |
| 2.3.6 目的基因片段的胶回收 | 第17-18页 |
| 2.3.7 P.pastoris感受态细胞的制备 | 第18页 |
| 2.3.8 重组P.pastoris的构建与筛选 | 第18-19页 |
| 2.3.9 重组质粒pPICZA-Mpr1的构建与鉴定 | 第19-20页 |
| 2.3.10 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-pho感受态细胞的制备 | 第20页 |
| 2.3.11 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-pho/pPICZA-Mpr1的构建与筛选 | 第20页 |
| 2.4 分析方法 | 第20-24页 |
| 2.4.1 P.pastoris菌浓 (OD600) 测定 | 第20页 |
| 2.4.2 酵母细胞干重 (DCW) 的分析 | 第20页 |
| 2.4.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第20-21页 |
| 2.4.4 蛋白含量的测定 | 第21页 |
| 2.4.5 磷脂酶酶活的测定方法 | 第21页 |
| 2.4.6 脂肪酶酶活的测定方法 | 第21页 |
| 2.4.7 重组磷脂酶B的纯化 | 第21-22页 |
| 2.4.8 重组磷脂酶B的最适反应pH和pH稳定性分析 | 第22页 |
| 2.4.9 重组磷脂酶B的最适反应温度和热稳定性分析 | 第22页 |
| 2.4.10 大豆原油中磷含量的检测方法 | 第22-23页 |
| 2.4.11 磷脂酶B的特异性水解实验 | 第23-24页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第24-46页 |
| 3.1 磷脂酶B在P.pastoris中的重组表达和发酵 | 第24-34页 |
| 3.1.1 重组质粒pPIC9K-pho的构建 | 第24-25页 |
| 3.1.2 重组P.pastoris GS115/pPIC9K-pho的构建与筛选 | 第25页 |
| 3.1.3 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-pho的构建与筛选 | 第25页 |
| 3.1.4 重组P.pastoris GS115/pPIC9K-pho的摇瓶培养和诱导表达 | 第25页 |
| 3.1.5 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-pho的摇瓶培养和诱导表达 | 第25-28页 |
| 3.1.6 两种重组菌株的 3.6 L发酵罐中制备磷脂酶B产量的比较 | 第28-29页 |
| 3.1.7 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-pho的 3.6 L发酵罐发酵条件优化 | 第29-34页 |
| 3.2 共表达N-乙酰转移酶和磷脂酶B重组菌的构建和发酵 | 第34-41页 |
| 3.2.1 重组表达载体pPICZA-Mpr1的构建 | 第34-35页 |
| 3.2.2 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-pho/pPICZA-Mpr1的构建和筛选 | 第35页 |
| 3.2.3 重组P.pastoris的摇瓶诱导发酵 | 第35-36页 |
| 3.2.4 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-pho/pPICZA-Mpr1的发酵条件优化 | 第36-41页 |
| 3.3 重组磷脂酶B的酶学性质和在大豆原油脱胶应用中反应条件的优化 | 第41-46页 |
| 3.3.1 重组酶的分离纯化 | 第41-42页 |
| 3.3.2 重组酶的酶学性质 | 第42-43页 |
| 3.3.3 重组酶在原油脱胶应用中的反应条件优化 | 第43-46页 |
| 主要结论与展望 | 第46-48页 |
| 主要结论 | 第46页 |
| 展望 | 第46-48页 |
| 致谢 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-52页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第52页 |
