| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第11-24页 |
| 1.1 纤维素酶与木质纤维素 | 第11-14页 |
| 1.1.1 纤维素酶简介 | 第11-12页 |
| 1.1.2 纤维素酶的作用机制 | 第12页 |
| 1.1.3 纤维素酶的应用价值 | 第12页 |
| 1.1.4 木质纤维素 | 第12-14页 |
| 1.2 里氏木霉和黑曲霉 | 第14-18页 |
| 1.2.1 里氏木霉简介 | 第14-15页 |
| 1.2.2 里氏木霉高产纤维素酶突变菌株 | 第15页 |
| 1.2.3 里氏木霉的纤维素酶系 | 第15-18页 |
| 1.2.4 黑曲霉简介 | 第18页 |
| 1.3 根癌农杆菌介导的真菌转染技术 | 第18-21页 |
| 1.3.1 根癌农杆菌简介 | 第18-19页 |
| 1.3.2 转染原理 | 第19-20页 |
| 1.3.3 T-DNA转化真菌的方式 | 第20-21页 |
| 1.3.4 农杆菌介导真菌转染的应用 | 第21页 |
| 1.4 黄曲霉素 | 第21-23页 |
| 1.4.1 黄曲霉毒素简介 | 第21-22页 |
| 1.4.2 黄曲霉素的检测方法 | 第22页 |
| 1.4.3 黄曲霉素的降解方法研究 | 第22-23页 |
| 1.5 本课题的意义和目的 | 第23-24页 |
| 第2章 双元载体的构建 | 第24-41页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第24-25页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第25-26页 |
| 2.2.3 主要培养基和溶液 | 第26页 |
| 2.2.4 主要试剂 | 第26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-33页 |
| 2.3.1 真菌基因组的提取 | 第26页 |
| 2.3.2 引物设计及PCR | 第26-28页 |
| 2.3.3 DNA产物纯化及胶回收 | 第28页 |
| 2.3.4 酶切与连接 | 第28页 |
| 2.3.5 转化大肠杆菌DH5α | 第28-29页 |
| 2.3.6 双元载体p1300-w1和p1300-w2的构建流程 | 第29-32页 |
| 2.3.7 双元载体p1300-w5的构建流程 | 第32-33页 |
| 2.4 实验结果 | 第33-40页 |
| 2.4.1 双元载体p1300-w1/p1300-w2的构建 | 第33-37页 |
| 2.4.2 双元载体p1300-w5的构建 | 第37-40页 |
| 2.5 小结 | 第40-41页 |
| 第3章 农杆菌介导的β-葡萄糖苷酶及漆酶基因转染里氏木霉 | 第41-55页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料 | 第41-44页 |
| 3.2.1 实验所用菌种与质粒 | 第41-42页 |
| 3.2.2 主要实验试剂 | 第42页 |
| 3.2.3 主要培养基 | 第42-43页 |
| 3.2.4 主要溶液 | 第43-44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-47页 |
| 3.3.1 根癌农杆菌感受态制备和转化: | 第44页 |
| 3.3.2 农杆菌介导转染里氏木霉 | 第44页 |
| 3.3.3 里氏木霉的培养与发酵方式 | 第44页 |
| 3.3.4 酶活测定方法 | 第44-46页 |
| 3.3.5 突变株的遗传稳定性测试 | 第46页 |
| 3.3.6 酶的分离纯化 | 第46-47页 |
| 3.4 实验结果 | 第47-53页 |
| 3.4.1 双元载体p1300-w1/p1300-w2转化农杆菌 | 第47页 |
| 3.4.2 根癌农杆菌介导p1300-w1/p1300-w2转染里氏木霉及转化子筛选 | 第47-49页 |
| 3.4.3 遗传稳定性测试以及发酵稳定性测试 | 第49页 |
| 3.4.4 基因组抽提并PCR验证 | 第49-50页 |
| 3.4.5 β-葡萄糖苷酶n的蛋白图谱分析 | 第50-51页 |
| 3.4.6 双元载体p1300-w5转化根癌农杆菌GV3101 | 第51页 |
| 3.4.7 β-葡萄糖苷酶与漆酶共表达菌株的筛选 | 第51-52页 |
| 3.4.8 共表达菌株的遗传稳定性测试 | 第52页 |
| 3.4.9 培养基选择及铜离子浓度优化 | 第52-53页 |
| 3.4.10 双酶共表达转化株的初次筛选 | 第53页 |
| 3.4.11 PCR鉴定 | 第53页 |
| 3.5 小结 | 第53-55页 |
| 第4章 共表达转化子与野生菌的差异对比 | 第55-68页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1 实验所用菌种 | 第55页 |
| 4.2.2 主要溶液 | 第55-56页 |
| 4.2.3 实验仪器与试剂 | 第56页 |
| 4.3 实验方法 | 第56-60页 |
| 4.3.1 接种与培养 | 第56页 |
| 4.3.2 转化子与野生株的酶活测定 | 第56-57页 |
| 4.3.3 SYBR相对荧光定量PCR分析T.reesei中各纤维素酶转录水平 | 第57-59页 |
| 4.3.4 糖化实验 | 第59-60页 |
| 4.4 实验结果与分析 | 第60-66页 |
| 4.4.1 β-葡萄糖苷酶和漆酶共表达菌株的产漆酶情况 | 第60-61页 |
| 4.4.2 转化株和原始菌株的发酵活性分析 | 第61-63页 |
| 4.4.3 荧光定量PCR结果分析 | 第63-65页 |
| 4.4.4 糖化实验结果 | 第65-66页 |
| 4.5 小结 | 第66-68页 |
| 第5章 农杆菌介导黄曲霉素降解酶基因在里氏木霉和黑曲霉中的表达 | 第68-76页 |
| 5.1 引言 | 第68页 |
| 5.2 实验材料 | 第68-69页 |
| 5.2.1 实验所用菌种与质粒 | 第68-69页 |
| 5.2.2 主要生物试剂和化学试剂 | 第69页 |
| 5.3 实验方法 | 第69-70页 |
| 5.3.1 质粒p1300-w6和p1300-w7的构建 | 第69-70页 |
| 5.3.2 HPLC法检测黄曲霉素降解酶活力 | 第70页 |
| 5.4 实验结果与分析 | 第70-75页 |
| 5.4.1 atdz基因的选择 | 第70页 |
| 5.4.2 引物设计 | 第70页 |
| 5.4.3 假蜜环菌RNA的提取、反转录及黄曲霉素降解酶mRNA序列的扩增 | 第70-71页 |
| 5.4.4 质粒p1300-w6及p1300-w7的构建及转化GV3101 | 第71-72页 |
| 5.4.5 p1300-w6/p1300-w7转化黑曲霉和里氏木霉 | 第72-73页 |
| 5.4.6 基因组抽提并鉴定转化子 | 第73-74页 |
| 5.4.7 黄曲霉素降解酶的表达 | 第74-75页 |
| 5.5 小结 | 第75-76页 |
| 第6章 结论与展望 | 第76-78页 |
| 6.1 结论 | 第76页 |
| 6.2 展望 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
