| 致谢 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-19页 |
| 1.1 研究背景与意义 | 第11页 |
| 1.2 菊粉及菊粉酶概述 | 第11-12页 |
| 1.2.1 菊粉 | 第11-12页 |
| 1.2.2 菊粉酶 | 第12页 |
| 1.3 微生物菊粉酶的研究现状 | 第12-15页 |
| 1.3.1 微生物菊粉酶的生产 | 第12-13页 |
| 1.3.2 内切菊粉酶的性质 | 第13页 |
| 1.3.3 菊粉酶的应用 | 第13-15页 |
| 1.3.3.1 菊粉酶在高果糖浆生产中的应用 | 第13-14页 |
| 1.3.3.2 菊粉酶在酒精生产中的应用 | 第14页 |
| 1.3.3.3 菊粉酶在单细胞油脂生产中的应用 | 第14页 |
| 1.3.3.4 菊粉酶在乳酸生产上的应用 | 第14页 |
| 1.3.3.5 内切菊粉酶在制备低聚果糖上的应用 | 第14-15页 |
| 1.4 酶法生产低聚果糖 | 第15-16页 |
| 1.4.1 酶法转移生产低聚果糖 | 第15页 |
| 1.4.2 酶法水解生产低聚果糖 | 第15-16页 |
| 1.5 微生物表面展示技术 | 第16-18页 |
| 1.5.1 微生物表面展示概述 | 第16-17页 |
| 1.5.2 酵母表面展示系统的应用研究 | 第17-18页 |
| 1.6 研究目的及研究内容 | 第18-19页 |
| 第二章 内切菊粉酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究 | 第19-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-22页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第19页 |
| 2.1.2 酶与试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.3 培养基与储液 | 第20-21页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第21-22页 |
| 2.1.5 相关引物 | 第22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-26页 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 | 第22-24页 |
| 2.2.1.1 提取A. niger DSM 2466基因组 | 第22-23页 |
| 2.2.1.2 内切菊粉酶基因的扩增 | 第23页 |
| 2.2.1.3 重组质粒Blunt-Inu的构建 | 第23页 |
| 2.2.1.4 重组质粒Blunt-Inu的提取 | 第23页 |
| 2.2.1.5 重组质粒Blunt-Inu的双酶切验证 | 第23-24页 |
| 2.2.1.6 双酶切产物的胶回收 | 第24页 |
| 2.2.1.7 重组质粒pETDuet-Inu的构建 | 第24页 |
| 2.2.2 重组大肠杆菌的构建 | 第24-25页 |
| 2.2.2.1 重组质粒的转化 | 第24页 |
| 2.2.2.2 重组质粒的验证 | 第24-25页 |
| 2.2.3 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第25页 |
| 2.2.3.1 重组大肠杆菌的诱导 | 第25页 |
| 2.2.3.2 粗酶液的提取 | 第25页 |
| 2.2.3.3 重组内切菊粉酶的纯化 | 第25页 |
| 2.2.4 内切菊粉酶酶学性质的研究 | 第25-26页 |
| 2.2.4.1 温度对重组内切菊粉酶活力的影响 | 第25页 |
| 2.2.4.2 pH对重组内切菊粉酶活力的影响 | 第25页 |
| 2.2.4.3 金属离子对重组内切菊粉酶活力的影响 | 第25-26页 |
| 2.3 分析方法 | 第26-27页 |
| 2.3.1 细胞浓度(OD_(600 nm))的测定 | 第26页 |
| 2.3.2 蛋白浓度的测定 | 第26页 |
| 2.3.3 重组内切菊粉酶酶活的测定 | 第26-27页 |
| 2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第27页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第27-34页 |
| 2.4.1 内切菊粉酶重组大肠杆菌的构建 | 第27-31页 |
| 2.4.1.1 内切菊粉酶基因的扩增 | 第27-28页 |
| 2.4.1.2 重组质粒Blunt-Inu的构建 | 第28页 |
| 2.4.1.3 大肠杆菌表达载体的构建 | 第28-31页 |
| 2.4.2 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第31-32页 |
| 2.4.3 内切菊粉酶酶学性质分析 | 第32-34页 |
| 2.4.3.1 温度对重组内切菊粉酶活力的影响 | 第32页 |
| 2.4.3.2 pH对重组内切菊粉酶活力的影响 | 第32-33页 |
| 2.4.3.3 金属离子对重组内切菊粉酶活力的影响 | 第33-34页 |
| 2.5 本章小结 | 第34-35页 |
| 第三章 内切菊粉酶在毕赤酵母中的重组表达及低聚果糖制备 | 第35-53页 |
| 3.1 实验材料 | 第35-38页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第35页 |
| 3.1.2 酶与试剂 | 第35-36页 |
| 3.1.3 培养基与储液 | 第36-37页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第37页 |
| 3.1.5 相关引物 | 第37-38页 |
| 3.2 实验方法 | 第38-42页 |
| 3.2.1 Inu基因的密码子偏好性优化和pPIC9K-Inuop质粒的构建 | 第38页 |
| 3.2.2 毕赤酵母基因工程菌的构建、筛选与诱导表达 | 第38-40页 |
| 3.2.2.1 pPIC9K-Inuop质粒的提取及验证 | 第38页 |
| 3.2.2.2 重组质粒线性化及提纯 | 第38页 |
| 3.2.2.3 毕赤酵母电击感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| 3.2.2.4 线性化表达载体电转化 | 第39页 |
| 3.2.2.5 重组毕赤酵母的高拷贝筛选 | 第39页 |
| 3.2.2.6 重组毕赤酵母基因组PCR验证 | 第39-40页 |
| 3.2.2.7 重组P. pastoris KM71的摇瓶培养和诱导产酶 | 第40页 |
| 3.2.3 重组P. pastoris KM71的 3 L发酵罐高密度培养 | 第40-41页 |
| 3.2.3.1 甘油间歇期 | 第40-41页 |
| 3.2.3.2 甘油的流加阶段 | 第41页 |
| 3.2.3.3 甲醇流加阶段 | 第41页 |
| 3.2.4 重组内切菊粉酶酶解生产低聚果糖的工艺优化 | 第41-42页 |
| 3.3 分析方法 | 第42-43页 |
| 3.3.1 细胞浓度(OD_(600 nm))的测定 | 第42页 |
| 3.3.2 蛋白浓度的测定 | 第42页 |
| 3.3.3 重组内切菊粉酶酶活测定 | 第42页 |
| 3.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第42页 |
| 3.3.5 HPAEC检测低聚果糖 | 第42-43页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第43-52页 |
| 3.4.1 重组毕赤酵母菌株的构建 | 第43-44页 |
| 3.4.1.1 黑曲霉内切菊粉酶密码子偏好性的优化 | 第43页 |
| 3.4.1.2 内切菊粉酶重组毕赤酵母菌株的构建与筛选 | 第43-44页 |
| 3.4.2 重组毕赤酵母的高密度发酵 | 第44-47页 |
| 3.4.2.1 种子培养 | 第44-45页 |
| 3.4.2.2 甘油间歇期 | 第45页 |
| 3.4.2.3 甘油补料阶段 | 第45-46页 |
| 3.4.2.4 甲醇诱导阶段 | 第46-47页 |
| 3.4.3 酶解生产低聚果糖工艺的优化 | 第47-52页 |
| 3.4.3.1 不同温度对酶解菊粉的影响 | 第47-48页 |
| 3.4.3.2 不同pH对酶解菊粉的影响 | 第48-49页 |
| 3.4.3.3 不同底物浓度对酶解菊粉的影响 | 第49-50页 |
| 3.4.3.4 不同酶用量对酶解菊粉的影响 | 第50-51页 |
| 3.4.3.5 酶解时间对产物组成变化的影响 | 第51-52页 |
| 3.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 内切菊粉酶在酵母细胞表面展示的研究 | 第53-69页 |
| 4.1 实验材料 | 第53-55页 |
| 4.1.1 菌种与质粒 | 第53页 |
| 4.1.2 酶与试剂 | 第53-54页 |
| 4.1.3 培养基与储液 | 第54-55页 |
| 4.2 实验方法 | 第55-60页 |
| 4.2.1 内切菊粉酶在酿酒酵母细胞表面展示系统的构建 | 第55-57页 |
| 4.2.1.1 重组质粒pPIC9K-Inuop和质粒pYD1的双酶切 | 第55页 |
| 4.2.1.2 表面展示载体pYD1-Inuop的构建 | 第55-56页 |
| 4.2.1.3 酿酒酵母EBY100感受态的制备 | 第56页 |
| 4.2.1.4 醋酸锂法转化酿酒酵母EBY100感受态细胞 | 第56页 |
| 4.2.1.5 外源蛋白的诱导表达 | 第56-57页 |
| 4.2.2 内切菊粉酶在毕赤酵母细胞表面展示的构建 | 第57-60页 |
| 4.2.2.1 酿酒酵母EBY100基因组的提取 | 第57页 |
| 4.2.2.2 PCR扩增Pir 1 锚定蛋白基因 | 第57页 |
| 4.2.2.3 质粒和PCR产物的双酶切与胶回收 | 第57-58页 |
| 4.2.2.4 pPIC9K-Pir1质粒的构建 | 第58页 |
| 4.2.2.5 pPIC9K-Pir1质粒的验证 | 第58页 |
| 4.2.2.6 PCR扩增Inuop片段 | 第58-59页 |
| 4.2.2.7 pPIC9K-Pir1质粒和Inuop PCR产物的双酶切胶回收 | 第59页 |
| 4.2.2.7 pPIC9K-Inuop-Pir1的构建 | 第59页 |
| 4.2.2.8 重组质粒pPIC9K-Inuop-Pir1的验证 | 第59页 |
| 4.2.2.9 重组毕赤酵母KM71-pPIC9K-Inuop-Pir1的构建 | 第59-60页 |
| 4.2.2.10 重组毕赤酵母KM71-pPIC9K-Inuop-Pir1的诱导表达 | 第60页 |
| 4.3 分析方法 | 第60-61页 |
| 4.3.1 细胞浓度(OD_(600 nm))的测定 | 第60页 |
| 4.3.2 内切菊粉酶酶活的测定 | 第60页 |
| 4.3.3 OD值与菌体浓度曲线 | 第60-61页 |
| 4.3.4 免疫荧光检测 | 第61页 |
| 4.3.4.1 重组酿酒酵母菌株的免疫荧光检测 | 第61页 |
| 4.3.4.2 重组毕赤酵母菌株的免疫荧光检测 | 第61页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第61-68页 |
| 4.4.1 内切菊粉酶在酿酒酵母细胞表面的展示研究 | 第61-64页 |
| 4.4.1.1 酿酒酵母EBY100表面展示载体pYD1-Inu的构建 | 第61-63页 |
| 4.4.1.2 酵母细胞转化与目的转化子筛选 | 第63页 |
| 4.4.1.3 融合蛋白的诱导表达 | 第63-64页 |
| 4.4.2 内切菊粉酶在毕赤酵母细胞表面的展示研究 | 第64-68页 |
| 4.4.2.1 重组质粒的pPIC9K-Pir1构建 | 第64-65页 |
| 4.4.2.2 重组质粒的pPIC9K-Inuop-Pir1构建 | 第65-66页 |
| 4.4.2.3 重组毕赤酵母菌株的构建与筛选 | 第66-67页 |
| 4.4.2.4 重组内切菊粉酶和Pir1融合蛋白在毕赤酵母中的表达 | 第67-68页 |
| 4.5 本章小结 | 第68-69页 |
| 第五章 结论与展望 | 第69-71页 |
| 5.1 结论 | 第69页 |
| 5.2 展望 | 第69-71页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-78页 |
