| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-17页 |
| 1.1 结节性硬化症 | 第11页 |
| 1.2 肿瘤抑制基因TSC1和TSC2 | 第11-12页 |
| 1.3 TSC1/TSC2复合物的生物学功能 | 第12-14页 |
| 1.4 TSC1和TSC2蛋白 | 第14-15页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第15-17页 |
| 第二章 材料和方法 | 第17-36页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第17-20页 |
| 2.1.1 菌株和细胞株 | 第17页 |
| 2.1.2 载体 | 第17页 |
| 2.1.3 基因 | 第17-18页 |
| 2.1.4 试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.5 溶液配制 | 第19-20页 |
| 2.2 实验仪器 | 第20-21页 |
| 2.3 实验方法 | 第21-36页 |
| 2.3.1 蛋白序列的生物信息学分析 | 第21-22页 |
| 2.3.2 目的片段PCR扩增 | 第22-23页 |
| 2.3.3 PCR产物的回收 | 第23-24页 |
| 2.3.4 载体和片段酶切连接 | 第24页 |
| 2.3.5 重组克隆的菌落PCR鉴定和质粒抽提 | 第24-25页 |
| 2.3.6 Dpn I消化法 | 第25-26页 |
| 2.3.7 同源重组构建克隆 | 第26页 |
| 2.3.8 原核表达系统表达目的蛋白 | 第26-27页 |
| 2.3.9 Expi293F表达系统简介 | 第27页 |
| 2.3.10 Expi293F细胞的复苏和传代 | 第27-28页 |
| 2.3.11 Expi293F细胞的冻存 | 第28页 |
| 2.3.12 Expi293F细胞的转染 | 第28-29页 |
| 2.3.13 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统简介 | 第29页 |
| 2.3.14 重组杆状病毒的制备 | 第29-30页 |
| 2.3.15 重组杆状病毒的制备 | 第30-31页 |
| 2.3.16 感染昆虫细胞表达目的蛋白 | 第31页 |
| 2.3.17 Ni-NTA亲和纯化 | 第31-32页 |
| 2.3.18 MBP融合蛋白的亲和纯化 | 第32页 |
| 2.3.19 Anti-Flag柱亲和纯化 | 第32-33页 |
| 2.3.20 离子交换层析 | 第33-34页 |
| 2.3.21 凝胶过滤层析 | 第34页 |
| 2.3.22 蛋白的Trypsin梯度酶切 | 第34-35页 |
| 2.3.23 融合蛋白的TEV酶切 | 第35页 |
| 2.3.24 蛋白结晶初筛 | 第35-36页 |
| 第三章 TSC1和TSC2结构域的原核表达 | 第36-52页 |
| 3.1 蛋白序列的生物信息学分析 | 第36-39页 |
| 3.2 原核表达的人TSC1 N端结构域聚合 | 第39-41页 |
| 3.3 原核表达S. pombe TSC1和TSC2 C端截短不理想 | 第41页 |
| 3.4 TSC1 coiled coil结构域的原核表达 | 第41-47页 |
| 3.4.1 人TSC1 coiled coil MBP融合蛋白沉淀 | 第42页 |
| 3.4.2 S. pombe TSC1 coiled coil结构域的表达优化 | 第42-45页 |
| 3.4.3 S. pombe TSC1540-675 MBP融合蛋白稳定 | 第45-47页 |
| 3.5 TSC2 GAP结构域的原核表达 | 第47-50页 |
| 3.5.1 S. pombe TSC2 GAP结构域沉淀 | 第47页 |
| 3.5.2 人TSC2 GAP结构域沉淀 | 第47-48页 |
| 3.5.3 人TSC2 GAP的核心结构可溶 | 第48-50页 |
| 3.6 本章小结 | 第50-52页 |
| 第四章S. pombe TSC1和TSC2的昆虫细胞表达 | 第52-74页 |
| 4.1 Ni柱纯化S. pombe TSC1 FL和TSC2 FL | 第52-53页 |
| 4.2 S. pombe TSC1 ?C和TSC2 FL共表达Ni柱纯化 | 第53-57页 |
| 4.2.1 S. pombe TSC1和TSC2突变蛋白的杆状病毒制备 | 第53-54页 |
| 4.2.2 S. pombe TSC11-716 aa表达量提高 | 第54-55页 |
| 4.2.3 S. pombe TSC11-795 aa表达量提高 | 第55-57页 |
| 4.3 Ni柱无法纯化低表达量的TSC2 ?C | 第57-58页 |
| 4.4 S. pombe TSC1单独表达和Trypsin酶切分析 | 第58-60页 |
| 4.5 S. pombe TSC1和TSC2共表达Anti-Flag柱纯化 | 第60-66页 |
| 4.5.1 构建S. pombe TSC1-His和TSC2-Flag克隆 | 第60-61页 |
| 4.5.2 Anti-Flag纯化得到S. pombe TSC1/2 FL复合物 | 第61-62页 |
| 4.5.3 S. pombe TSC1 ?C影响TSC2 FL的表达量 | 第62-66页 |
| 4.6 TSC11-799 aa/TSC2复合物Trypsin酶切分析 | 第66页 |
| 4.7 S. pombe TSC11-799 ?450-520 aa的表达纯化 | 第66-68页 |
| 4.7.1 S. pombe TSC11-799 ?450-520 aa聚合度提高 | 第67页 |
| 4.7.2 S. pombe TSC1 ?450-520 aa不影响和TSC1/2 复合物的聚合状态 | 第67-68页 |
| 4.8 S. pombe TSC2 N端结构域和GAP结构域相对独立 | 第68-70页 |
| 4.9 TSC2 ?C表达情况不如TSC2 FL | 第70-71页 |
| 4.10 TSC2 GAP是否结合N端结构域有待验证 | 第71-72页 |
| 4.11 本章小结 | 第72-74页 |
| 第五章 人TSC1和TSC2的Expi293F细胞表达 | 第74-80页 |
| 5.1 人TSC1 FL/TSC2 FL高度聚合 | 第74-75页 |
| 5.2 人TSC1 FL、TSC2 FL和TBC1D7共表达Anti-Flag纯化 | 第75-76页 |
| 5.3 人TSC1 FL和TSC21-1740 aa共表达Anti-Flag纯化 | 第76页 |
| 5.4 人TSC1截短和删去突变降低表达量 | 第76-78页 |
| 5.5 人TSC2截短和删去突变不利于表达 | 第78-79页 |
| 5.6 本章小结 | 第79-80页 |
| 第六章 TSC1和TSC2蛋白性质探讨 | 第80-84页 |
| 6.1 TSC1的N端结构域分析 | 第80-81页 |
| 6.2 TSC1的coiled coil结构域和聚合状态分析 | 第81-82页 |
| 6.3 TSC2的GAP结构域分析 | 第82页 |
| 6.4 TSC1和TSC2的相互作用分析 | 第82-84页 |
| 第七章 总结和展望 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-90页 |
| 附录 | 第90-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 | 第95-97页 |
