| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-18页 |
| 1.1 邻氯扁桃酸是合成药物的重要手性中间体 | 第10-11页 |
| 1.1.1 邻氯扁桃酸简介 | 第10页 |
| 1.1.2 2-Cl-MA的用途 | 第10-11页 |
| 1.2 (R)-2-Cl-MA的制备方法 | 第11-13页 |
| 1.2.1 物理法和化学法 | 第11页 |
| 1.2.2 生物催化法 | 第11-13页 |
| 1.2.2.1 酯酶/脂肪酶拆分法 | 第12-13页 |
| 1.2.2.2 羰基还原酶法制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯 | 第13页 |
| 1.2.2.3 羟腈化酶法 | 第13页 |
| 1.3 腈水解酶法制备(R)-2-Cl-MA的现状 | 第13-17页 |
| 1.3.1 腈水解酶 | 第13-15页 |
| 1.3.2 腈水解酶水解机理 | 第15页 |
| 1.3.3 腈水解酶法制备(R)-2-Cl-MA的原理 | 第15-16页 |
| 1.3.4 已知能水解2-Cl-MN的腈水解酶 | 第16页 |
| 1.3.5 腈水解酶的获得方法 | 第16-17页 |
| 1.4 课题的研究目的和思路 | 第17-18页 |
| 第2章 腈水解酶的数据库挖掘 | 第18-31页 |
| 2.1 引言 | 第18页 |
| 2.2 材料与方法 | 第18-25页 |
| 2.2.1 主要试剂 | 第18-19页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第19页 |
| 2.2.3 所涉菌株 | 第19-20页 |
| 2.2.4 培养基 | 第20页 |
| 2.2.5 腈水解酶基因的选取 | 第20页 |
| 2.2.6 腈水解酶基因的克隆 | 第20-23页 |
| 2.2.6.1 基因组提取 | 第20页 |
| 2.2.6.2 引物设计 | 第20-22页 |
| 2.2.6.3 腈水解酶基因的PCR反应 | 第22页 |
| 2.2.6.4 连T载体 | 第22页 |
| 2.2.6.5 表达载体的构建 | 第22-23页 |
| 2.2.7 腈水解酶的诱导表达 | 第23页 |
| 2.2.8 腈水解酶对2-Cl-MN的选择性和活力的测定 | 第23-24页 |
| 2.2.8.1 腈水解酶活力的测定 | 第23-24页 |
| 2.2.8.2 腈水解酶选择性的测定 | 第24页 |
| 2.2.9 分析方法 | 第24-25页 |
| 2.2.9.1 Bradford法测定蛋白含量 | 第24页 |
| 2.2.9.2 苯酚次氯酸钠法测定铵离子含量 | 第24-25页 |
| 2.2.9.3 外标法测定2-Cl-MA生成量 | 第25页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第25-30页 |
| 2.3.1 腈水解酶基因的选取 | 第25-28页 |
| 2.3.2 腈水解酶的克隆与表达 | 第28-30页 |
| 2.4 本章小结 | 第30-31页 |
| 第3章 腈水解酶的酶学性质研究 | 第31-42页 |
| 3.1 引言 | 第31页 |
| 3.2 材料与方法 | 第31-33页 |
| 3.2.1 仪器、试剂以及分析方法 | 第31页 |
| 3.2.2 重组腈水解酶LaN的诱导表达 | 第31页 |
| 3.2.3 重组腈水解酶LaN的纯化 | 第31-32页 |
| 3.2.4 重组腈水解酶LaN的酶学性质研究 | 第32-33页 |
| 3.2.4.1 LaN的最适pH | 第32页 |
| 3.2.4.2 LaN的最适温度 | 第32页 |
| 3.2.4.3 LaN的热稳定性 | 第32页 |
| 3.2.4.4 LaN的pH稳定性 | 第32页 |
| 3.2.4.5 金属离子以及EDTA对LaN活力的影响 | 第32页 |
| 3.2.4.6 LaN的底物特异性 | 第32页 |
| 3.2.4.7 LaN动力学常数的测定 | 第32-33页 |
| 3.3 LaN的酶学性质 | 第33-40页 |
| 3.3.1 重组腈水解酶LaN的纯化 | 第33-34页 |
| 3.3.2 腈水解酶LaN的最适pH | 第34页 |
| 3.3.3 腈水解酶LaN的最适温度 | 第34-35页 |
| 3.3.4 腈水解酶LaN的pH稳定性 | 第35页 |
| 3.3.5 腈水解酶LaN的热稳定性 | 第35-36页 |
| 3.3.6 金属离子以及EDTA对腈水解酶LaN活力的影响 | 第36-37页 |
| 3.3.7 LaN动力学常数的测定 | 第37-38页 |
| 3.3.8 腈水解酶LaN的底物特异性 | 第38-40页 |
| 3.3.9 讨论 | 第40页 |
| 3.4 本章小结 | 第40-42页 |
| 第4章 邻氯扁桃腈的水解反应研究 | 第42-53页 |
| 4.1 引言 | 第42页 |
| 4.2 材料与方法 | 第42-45页 |
| 4.2.1 主要仪器和试剂 | 第42页 |
| 4.2.2 重组大肠杆菌的发酵制备 | 第42-43页 |
| 4.2.2.1 发酵所需培养基和补料配方 | 第42页 |
| 4.2.2.2 发酵方法 | 第42-43页 |
| 4.2.3 单水相中2-Cl-MN的水解反应 | 第43页 |
| 4.2.4 底物抑制和产物抑制的测定 | 第43-44页 |
| 4.2.5 单水相中分批补加底物反应 | 第44页 |
| 4.2.6 LaN整细胞的有机溶剂耐受性的考察 | 第44页 |
| 4.2.7 两相比例考察 | 第44页 |
| 4.2.8 两相体系中2-Cl-MN的水解反应研究 | 第44页 |
| 4.2.9 (R)2-Cl-MA的克级制备 | 第44-45页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第45-51页 |
| 4.3.1 LaN整细胞的制备 | 第45页 |
| 4.3.2 单水相中2-Cl-MN的水解反应结果 | 第45-46页 |
| 4.3.3 底物抑制 | 第46-47页 |
| 4.3.4 产物抑制 | 第47-48页 |
| 4.3.5 分批补加底物的水解反应 | 第48页 |
| 4.3.6 LaN整细胞的有机溶剂耐受性的考察 | 第48-49页 |
| 4.3.7 相比例的考察 | 第49-50页 |
| 4.3.8 两相反应体系中2-Cl-MN的水解反应 | 第50-51页 |
| 4.3.9 (R)-2-Cl-MA的克级制备 | 第51页 |
| 4.4 本章小结 | 第51-53页 |
| 结论与创新点 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-61页 |
| 攻读硕士期间撰写的论文和专利 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
