| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-21页 |
| 1.1 L-AAD脱氨酶概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 L-AAD的来源 | 第10页 |
| 1.1.2 L-AAD催化的反应类型 | 第10-12页 |
| 1.2 L-AAD的研究进展 | 第12-17页 |
| 1.2.1 L-AAD的结构 | 第12-13页 |
| 1.2.2 L-AAD的底物特异性 | 第13-14页 |
| 1.2.3 L-AAD分子改造及表达 | 第14-16页 |
| 1.2.4 L-AAD研究中存在的问题 | 第16页 |
| 1.2.5 L-AAD的应用 | 第16-17页 |
| 1.3 α-酮异己酸的应用及合成方法 | 第17-19页 |
| 1.3.1 α-酮异己酸的理化性质 | 第17页 |
| 1.3.2 α-酮异己酸的合成方法 | 第17-19页 |
| 1.4 立题依据及研究意义 | 第19页 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 L-AAD的异源表达、纯化和性质 | 第21-38页 |
| 2.1 前言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第21-25页 |
| 2.2.1 菌株、培养基及试剂 | 第21-22页 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 | 第22页 |
| 2.2.3 L-AAD在E. coli中表达及突变菌株构建 | 第22-23页 |
| 2.2.4 L-AAD的表达方法 | 第23-24页 |
| 2.2.5 蛋白纯化及纯化过程优化 | 第24页 |
| 2.2.6 催化活力和 α-酮异己酸测定方法 | 第24页 |
| 2.2.7 酶学性质测定方法 | 第24-25页 |
| 2.2.8 L-AAD的分子模型建立和分子对接 | 第25页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第25-37页 |
| 2.3.1 L-AAD的纯化与去垢剂装配条件优化 | 第25-28页 |
| 2.3.2 L-AAD的酶学性质测定 | 第28-31页 |
| 2.3.3 L-AAD的进化分析 | 第31-32页 |
| 2.3.4 L-AAD催化活性中心位点解析 | 第32-37页 |
| 2.4 本章小结 | 第37-38页 |
| 第三章 L-AAD的定位位置及细胞膜性质对L-AAD活性的影响 | 第38-52页 |
| 3.1 前言 | 第38页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第38-41页 |
| 3.2.1 菌株 | 第38页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第38-39页 |
| 3.2.3 软件 | 第39页 |
| 3.2.4 转录水平分析方法 | 第39页 |
| 3.2.5 蛋白提取方法和western blot方法 | 第39-40页 |
| 3.2.6 检测方法 | 第40-41页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第41-50页 |
| 3.3.1 L-AAD转运途径分析 | 第41-43页 |
| 3.3.2 L-AAD定位位置解析 | 第43-48页 |
| 3.3.3 细胞膜性质对L-AAD催化效率的影响 | 第48-50页 |
| 3.4 本章小结 | 第50-52页 |
| 第四章 利用L-AAD全细胞转化亮氨酸合成 α-酮异己酸 | 第52-65页 |
| 4.1 前言 | 第52页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第52-54页 |
| 4.2.1 菌株 | 第52页 |
| 4.2.2 全细胞的制备 | 第52-53页 |
| 4.2.3 全细胞催化条件优化方法 | 第53页 |
| 4.2.4 全细胞转化D型和L型亮氨酸方法 | 第53页 |
| 4.2.5 流加策略 | 第53页 |
| 4.2.6 固定化方法 | 第53-54页 |
| 4.3 实验结果 | 第54-64页 |
| 4.3.1 诱导条件优化 | 第54-55页 |
| 4.3.2 全细胞催化条件优化 | 第55-58页 |
| 4.3.3 不同底物类型对全细胞转化的影响 | 第58-59页 |
| 4.3.4 分批和流加补料策略优化 | 第59-63页 |
| 4.3.5 固定化对全细胞转化的影响 | 第63-64页 |
| 4.4 本章小结 | 第64-65页 |
| 第五章 转录和翻译水平提高L-AAD的催化活力 | 第65-81页 |
| 5.1 前言 | 第65页 |
| 5.2 材料与方法 | 第65-70页 |
| 5.2.1 基于mRNA的自由能的序列设计 | 第65-66页 |
| 5.2.2 基于RBS Calculator设计RBS序列设计 | 第66-67页 |
| 5.2.3 质粒构建方法 | 第67-70页 |
| 5.2.4 转录水平分析方法 | 第70页 |
| 5.2.5 实际质粒拷贝数计算 | 第70页 |
| 5.2.6 SDS-PAGE分析方法 | 第70页 |
| 5.2.7 全细胞制备方法和流加策略 | 第70页 |
| 5.2.8 产量和催化效率测定方法 | 第70页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第70-79页 |
| 5.3.1 编码区序列设计调控翻译水平 | 第70-73页 |
| 5.3.2 非编码区RBS序列设计调控翻译水平 | 第73-76页 |
| 5.3.3 不同质粒复制子调控转录水平 | 第76-78页 |
| 5.3.4 三种策略整合 | 第78-79页 |
| 5.4 本章小结 | 第79-81页 |
| 第六章 半理性设计提高L-AAD的热稳定性 | 第81-94页 |
| 6.1 前言 | 第81页 |
| 6.2 材料与方法 | 第81-84页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第81页 |
| 6.2.2 试剂与仪器 | 第81页 |
| 6.2.3 突变位点的选择 | 第81-82页 |
| 6.2.4 突变体文库的构建 | 第82-83页 |
| 6.2.5 饱和突变体文库的筛选方法 | 第83-84页 |
| 6.2.6 酶学性质和动力学常数测定方法 | 第84页 |
| 6.2.7 全细胞催化剂制备和底物流加方法 | 第84页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第84-93页 |
| 6.3.1 L-AAD的热稳定性 | 第84页 |
| 6.3.2 关键柔性残基的选择 | 第84-86页 |
| 6.3.3 L-AAD的突变体筛选 | 第86-89页 |
| 6.3.4 L-AAD突变体的酶学性质 | 第89-90页 |
| 6.3.5 热稳定性对全细胞转化合成 α-酮异己酸产量的影响 | 第90-91页 |
| 6.3.6 分子动力学和结构分析热稳定性提高原因 | 第91-93页 |
| 6.4 本章小结 | 第93-94页 |
| 主要结论与展望 | 第94-96页 |
| 论文创新点 | 第96-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-106页 |
| 附录I: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第106页 |
