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L-氨基酸脱氨酶分子改造及生物合成α-酮异己酸

摘要第3-5页
Abstract第5-6页
第一章 绪论第10-21页
    1.1 L-AAD脱氨酶概述第10-12页
        1.1.1 L-AAD的来源第10页
        1.1.2 L-AAD催化的反应类型第10-12页
    1.2 L-AAD的研究进展第12-17页
        1.2.1 L-AAD的结构第12-13页
        1.2.2 L-AAD的底物特异性第13-14页
        1.2.3 L-AAD分子改造及表达第14-16页
        1.2.4 L-AAD研究中存在的问题第16页
        1.2.5 L-AAD的应用第16-17页
    1.3 α-酮异己酸的应用及合成方法第17-19页
        1.3.1 α-酮异己酸的理化性质第17页
        1.3.2 α-酮异己酸的合成方法第17-19页
    1.4 立题依据及研究意义第19页
    1.5 本论文的主要研究内容第19-21页
第二章 L-AAD的异源表达、纯化和性质第21-38页
    2.1 前言第21页
    2.2 实验材料和方法第21-25页
        2.2.1 菌株、培养基及试剂第21-22页
        2.2.2 主要仪器与设备第22页
        2.2.3 L-AAD在E. coli中表达及突变菌株构建第22-23页
        2.2.4 L-AAD的表达方法第23-24页
        2.2.5 蛋白纯化及纯化过程优化第24页
        2.2.6 催化活力和 α-酮异己酸测定方法第24页
        2.2.7 酶学性质测定方法第24-25页
        2.2.8 L-AAD的分子模型建立和分子对接第25页
    2.3 结果与讨论第25-37页
        2.3.1 L-AAD的纯化与去垢剂装配条件优化第25-28页
        2.3.2 L-AAD的酶学性质测定第28-31页
        2.3.3 L-AAD的进化分析第31-32页
        2.3.4 L-AAD催化活性中心位点解析第32-37页
    2.4 本章小结第37-38页
第三章 L-AAD的定位位置及细胞膜性质对L-AAD活性的影响第38-52页
    3.1 前言第38页
    3.2 实验材料和方法第38-41页
        3.2.1 菌株第38页
        3.2.2 试剂和仪器第38-39页
        3.2.3 软件第39页
        3.2.4 转录水平分析方法第39页
        3.2.5 蛋白提取方法和western blot方法第39-40页
        3.2.6 检测方法第40-41页
    3.3 结果与讨论第41-50页
        3.3.1 L-AAD转运途径分析第41-43页
        3.3.2 L-AAD定位位置解析第43-48页
        3.3.3 细胞膜性质对L-AAD催化效率的影响第48-50页
    3.4 本章小结第50-52页
第四章 利用L-AAD全细胞转化亮氨酸合成 α-酮异己酸第52-65页
    4.1 前言第52页
    4.2 实验材料和方法第52-54页
        4.2.1 菌株第52页
        4.2.2 全细胞的制备第52-53页
        4.2.3 全细胞催化条件优化方法第53页
        4.2.4 全细胞转化D型和L型亮氨酸方法第53页
        4.2.5 流加策略第53页
        4.2.6 固定化方法第53-54页
    4.3 实验结果第54-64页
        4.3.1 诱导条件优化第54-55页
        4.3.2 全细胞催化条件优化第55-58页
        4.3.3 不同底物类型对全细胞转化的影响第58-59页
        4.3.4 分批和流加补料策略优化第59-63页
        4.3.5 固定化对全细胞转化的影响第63-64页
    4.4 本章小结第64-65页
第五章 转录和翻译水平提高L-AAD的催化活力第65-81页
    5.1 前言第65页
    5.2 材料与方法第65-70页
        5.2.1 基于mRNA的自由能的序列设计第65-66页
        5.2.2 基于RBS Calculator设计RBS序列设计第66-67页
        5.2.3 质粒构建方法第67-70页
        5.2.4 转录水平分析方法第70页
        5.2.5 实际质粒拷贝数计算第70页
        5.2.6 SDS-PAGE分析方法第70页
        5.2.7 全细胞制备方法和流加策略第70页
        5.2.8 产量和催化效率测定方法第70页
    5.3 结果与讨论第70-79页
        5.3.1 编码区序列设计调控翻译水平第70-73页
        5.3.2 非编码区RBS序列设计调控翻译水平第73-76页
        5.3.3 不同质粒复制子调控转录水平第76-78页
        5.3.4 三种策略整合第78-79页
    5.4 本章小结第79-81页
第六章 半理性设计提高L-AAD的热稳定性第81-94页
    6.1 前言第81页
    6.2 材料与方法第81-84页
        6.2.1 菌株和质粒第81页
        6.2.2 试剂与仪器第81页
        6.2.3 突变位点的选择第81-82页
        6.2.4 突变体文库的构建第82-83页
        6.2.5 饱和突变体文库的筛选方法第83-84页
        6.2.6 酶学性质和动力学常数测定方法第84页
        6.2.7 全细胞催化剂制备和底物流加方法第84页
    6.3 结果与讨论第84-93页
        6.3.1 L-AAD的热稳定性第84页
        6.3.2 关键柔性残基的选择第84-86页
        6.3.3 L-AAD的突变体筛选第86-89页
        6.3.4 L-AAD突变体的酶学性质第89-90页
        6.3.5 热稳定性对全细胞转化合成 α-酮异己酸产量的影响第90-91页
        6.3.6 分子动力学和结构分析热稳定性提高原因第91-93页
    6.4 本章小结第93-94页
主要结论与展望第94-96页
论文创新点第96-97页
致谢第97-98页
参考文献第98-106页
附录I: 作者在攻读博士学位期间发表的论文第106页

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