| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第一章 绪论 | 第16-46页 |
| 1.1 青霉素酰化酶 | 第16-27页 |
| 1.1.1 青霉素酰化酶的分类与来源 | 第16-17页 |
| 1.1.2 青霉素G酰化酶的结构和表达 | 第17-19页 |
| 1.1.3 青霉素G酰化酶的催化机理 | 第19-21页 |
| 1.1.4 青霉素G酰化酶的克隆研究进展 | 第21-25页 |
| 1.1.4.1 Escherichia coli PGA的克隆 | 第21-23页 |
| 1.1.4.2 Bacillus megaterium PGA的克隆 | 第23页 |
| 1.1.4.3 Alcaligenes faecalis PGA的克隆 | 第23-24页 |
| 1.1.4.4 Kluyvera citrophila PGA的克隆 | 第24页 |
| 1.1.4.5 Achromobacter xylosoxidans PGA的克隆 | 第24页 |
| 1.1.4.6 Provdencia rettgeri PGA的克隆 | 第24页 |
| 1.1.4.7 PGA克隆表达的宿主菌 | 第24-25页 |
| 1.1.4.8 不同来源PGA生产菌的优缺点 | 第25页 |
| 1.1.5 青霉素G酰化酶的应用 | 第25-27页 |
| 1.1.5.1 PGA在半合成抗生素中间体制备中的应用 | 第25-26页 |
| 1.1.5.2 在半合成β-内酰胺抗生素合成中的应用 | 第26页 |
| 1.1.5.3 在外消旋混合物的拆分中的应用 | 第26-27页 |
| 1.1.5.4 PGA在肽合成中的应用 | 第27页 |
| 1.2 邻氯苯甘氨酸 | 第27-38页 |
| 1.2.1 外消旋体拆分法 | 第28-36页 |
| 1.2.1.1 外消旋体的合成 | 第28-30页 |
| 1.2.1.2 外消旋体的拆分 | 第30-36页 |
| 1.2.1.2.1 非对映体盐拆分法 | 第30-32页 |
| 1.2.1.2.2 诱导结晶法 | 第32-33页 |
| 1.2.1.2.3 不对称转化拆分法 | 第33-34页 |
| 1.2.1.2.4 生物酶拆分法 | 第34-36页 |
| 1.2.2 不对称合成 | 第36-38页 |
| 1.2.2.1 不对称相转移催化法 | 第36-37页 |
| 1.2.2.2 生物酶转化法 | 第37-38页 |
| 1.3 本论文的选题意义及研究内容 | 第38-39页 |
| 参考文献 | 第39-46页 |
| 第二章 青霉素G酰化酶基因工程菌的构建及表达 | 第46-68页 |
| 2.1 引言 | 第46页 |
| 2.2 材料与方法 | 第46-56页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第46-47页 |
| 2.2.2 培养基 | 第47页 |
| 2.2.3 主要工具酶和试剂 | 第47-48页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第48页 |
| 2.2.5 PGA在大肠杆菌中的表达 | 第48-54页 |
| 2.2.5.1 PGA基因组的提取及PCR扩增 | 第48-50页 |
| 2.2.5.2 电泳检测PCR产物 | 第50页 |
| 2.2.5.3 青霉素G酰化酶基因PGA的克隆 | 第50-51页 |
| 2.2.5.4 双酶切体系的建立 | 第51页 |
| 2.2.5.5 胶回收酶切片段 | 第51页 |
| 2.2.5.6 胶回收产物与pCDFDuet-1的连接 | 第51-52页 |
| 2.2.5.7 大肠杆菌感受态的制备 | 第52页 |
| 2.2.5.8 连接产物的转化 | 第52页 |
| 2.2.5.9 菌落PCR | 第52-53页 |
| 2.2.5.10 PGA基因的诱导表达 | 第53页 |
| 2.2.5.11 重组PGA的SDS-PAGE分析 | 第53页 |
| 2.2.5.12 重组菌E. coli BL21(DE3) /pCDFDuet-PGA的酶活检测 | 第53-54页 |
| 2.2.6 PGA在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第54-56页 |
| 2.2.6.1 质粒pBluescript SK(+)-PGA和pPZW103的提取 | 第54页 |
| 2.2.6.2 酶切 | 第54页 |
| 2.2.6.3 胶回收酶切片段 | 第54页 |
| 2.2.6.4 胶回收产物与pPZW103的连接 | 第54-55页 |
| 2.2.6.5 枯草芽孢杆菌感受态的制备 | 第55页 |
| 2.2.6.6 连接产物的电转化 | 第55页 |
| 2.2.6.7 重组PGA的表达 | 第55页 |
| 2.2.6.8 重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA的酶活检测 | 第55-56页 |
| 2.2.7 分析方法 | 第56页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第56-65页 |
| 2.3.1 PGA在大肠杆菌中的表达 | 第56-60页 |
| 2.3.1.1 PGA的α和β亚基克隆 | 第56-57页 |
| 2.3.1.2 重组表达载体的构建 | 第57-58页 |
| 2.3.1.3 重组质粒的菌落PCR鉴定 | 第58-59页 |
| 2.3.1.4 表达产物SDS-PAGE分析 | 第59页 |
| 2.3.1.5 重组PGA酶活力的测定 | 第59-60页 |
| 2.3.2 PGA在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第60-65页 |
| 2.3.2.1 PGA基因序列的合成 | 第60-62页 |
| 2.3.2.2 重组表达载体的构建 | 第62页 |
| 2.3.2.3 重组PGA的SDS-PAGE分析 | 第62-63页 |
| 2.3.2.4 重组PGA酶活力的测定 | 第63页 |
| 2.3.2.5 pPZW103-PGA质粒稳定性的检测 | 第63-65页 |
| 2.3.3 讨论 | 第65页 |
| 2.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-68页 |
| 第三章 B.subtilis WB800/pPZW103-PGA培养条件的研究 | 第68-81页 |
| 3.1 引言 | 第68页 |
| 3.2 材料与方法 | 第68-70页 |
| 3.2.1 菌种 | 第68-69页 |
| 3.2.2 培养基 | 第69页 |
| 3.2.3 培养方法 | 第69页 |
| 3.2.4 胞外酶液催化水解N-苯乙酰-邻氯苯甘氨酸 | 第69页 |
| 3.2.5 生物量测定 | 第69页 |
| 3.2.6 分析方法 | 第69-70页 |
| 3.2.7 发酵优化 | 第70页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第70-79页 |
| 3.3.1 产物底物的分析 | 第70页 |
| 3.3.2 重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA发酵条件的优化 | 第70-78页 |
| 3.3.2.1 碳源的种类及浓度对菌体生长及产酶的影响 | 第70-72页 |
| 3.3.2.2 氮源对菌体生长和产酶的影响 | 第72-74页 |
| 3.3.2.3 磷酸盐对菌体生长和产酶的影响 | 第74页 |
| 3.3.2.4 金属离子对菌体生长和产酶的影响 | 第74-75页 |
| 3.3.2.5 初始pH对菌体生长和产酶的影响 | 第75-76页 |
| 3.3.2.6 培养温度对菌体生长和产酶的影响 | 第76页 |
| 3.3.2.7 摇瓶装液量对重组菌生长和PGA表达的影响 | 第76-77页 |
| 3.3.2.8 接种量对菌体生长和酶活力的影响 | 第77-78页 |
| 3.3.2.9 间歇培养过程中菌体生长及产酶曲线 | 第78页 |
| 3.3.3 5L发酵罐中菌体的生长以及产酶曲线 | 第78-79页 |
| 3.4 本章小结 | 第79页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| 第四章 重组青霉素G酰化酶的分离纯化及酶学特性研究 | 第81-110页 |
| 4.1 引言 | 第81页 |
| 4.2 材料与方法 | 第81-88页 |
| 4.2.1 菌株 | 第81页 |
| 4.2.2 培养基 | 第81-82页 |
| 4.2.3 实验试剂 | 第82页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第82页 |
| 4.2.5 主要溶液 | 第82-83页 |
| 4.2.6 蛋白质浓度测定 | 第83页 |
| 4.2.7 重组PGA活力的测定 | 第83页 |
| 4.2.8 重组PGA的分离纯化 | 第83-86页 |
| 4.2.8.1 硫酸铵初级盐析 | 第83-84页 |
| 4.2.8.2 硫酸铵次级盐析 | 第84页 |
| 4.2.8.3 弱碱性离子交换层析 | 第84页 |
| 4.2.8.4 疏水相互作用层析 | 第84-85页 |
| 4.2.8.5 SDS-PAGE电泳 | 第85-86页 |
| 4.2.8.6 蛋白质分子量的确定 | 第86页 |
| 4.2.9 重组PGA的酶学性质研究 | 第86-88页 |
| 4.2.9.1 重组PGA的最适pH及pH稳定性 | 第86页 |
| 4.2.9.2 重组PGA的最适温度及温度稳定性 | 第86页 |
| 4.2.9.3 金属离子和表面活性剂对重组PGA酶活的影响 | 第86页 |
| 4.2.9.4 重组PGA底物特异性的研究 | 第86-88页 |
| 4.2.9.4.1 底物的合成 | 第87页 |
| 4.2.9.4.2 手性色谱柱上不同底物产物的分离 | 第87-88页 |
| 4.2.9.4.3 重组PGA催化水解不同底物能力的比较 | 第88页 |
| 4.2.9.4.4 重组PGA催化各底物动力学常数的比较 | 第88页 |
| 4.2.9.4.5 同源建模及五种底物的分子对接 | 第88页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第88-107页 |
| 4.3.1 重组PGA的分离纯化 | 第88-92页 |
| 4.3.1.1 蛋白质标准曲线 | 第89页 |
| 4.3.1.2 硫酸铵分级盐析 | 第89-90页 |
| 4.3.1.2.1 硫酸铵初级盐析 | 第89页 |
| 4.3.1.2.2 硫酸铵次级盐析 | 第89-90页 |
| 4.3.1.3 DEAE弱碱性离子交换层析 | 第90-91页 |
| 4.3.1.4 t-Butyl疏水相互作用层析 | 第91页 |
| 4.3.1.5 各步PGA的比活力、回收率和纯化倍数 | 第91-92页 |
| 4.3.1.6 酶纯度的鉴定和分子量测定 | 第92页 |
| 4.3.2 重组PGA的酶学特性 | 第92-107页 |
| 4.3.2.1 重组PGA最适pH的测定 | 第92-93页 |
| 4.3.2.2 重组PGA的pH稳定性 | 第93-94页 |
| 4.3.2.3 重组PGA最适温度的测定 | 第94-95页 |
| 4.3.2.4 重组PGA的热稳定性 | 第95-96页 |
| 4.3.2.5 金属离子和表面活性剂对重组PGA酶活的影响 | 第96-97页 |
| 4.3.2.6 重组PGA的底物特异性 | 第97-107页 |
| 4.3.2.6.1 底物的合成 | 第98-99页 |
| 4.3.2.6.2 色谱柱上不同底物产物的分离 | 第99-100页 |
| 4.3.2.6.3 重组PGA催化水解不同底物能力的比较 | 第100-102页 |
| 4.3.2.6.4 重组PGA催化各底物动力学参数的比较 | 第102-103页 |
| 4.3.2.6.5 同源建模及五种底物的分子对接 | 第103-107页 |
| 4.4 本章小结 | 第107页 |
| 参考文献 | 第107-110页 |
| 第五章 重组青霉素G酰化酶催化拆分制备(S)-邻氯苯甘氨的研究 | 第110-128页 |
| 5.1 引言 | 第110-111页 |
| 5.2 材料与方法 | 第111-114页 |
| 5.2.1 菌株 | 第111页 |
| 5.2.2 化学试剂及树脂 | 第111页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第111页 |
| 5.2.4 酶液的制备 | 第111页 |
| 5.2.5 酶法拆分N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸 | 第111-112页 |
| 5.2.6 底物分批补料 | 第112页 |
| 5.2.7 产物的制备及表征 | 第112-113页 |
| 5.2.8 (R)-底物的外消旋化 | 第113-114页 |
| 5.2.9 分析方法 | 第114页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第114-125页 |
| 5.3.1 反应体系pH对PGA催化拆分的影响 | 第114-115页 |
| 5.3.2 不同酶量对PGA催化拆分的影响 | 第115-116页 |
| 5.3.3 底物浓度对PGA催化拆分的影响 | 第116-118页 |
| 5.3.4 产物浓度对PGA催化拆分的影响 | 第118-121页 |
| 5.3.5 分批补料 | 第121页 |
| 5.3.6 (S)-邻氯苯甘氨酸的制备及表征 | 第121-125页 |
| 5.3.7 (R)-2的消旋 | 第125页 |
| 5.4 本章小结 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-128页 |
| 第六章 结论与展望 | 第128-131页 |
| 6.1 结论 | 第128-129页 |
| 6.2 展望 | 第129-131页 |
| 附录 | 第131-136页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137页 |
