| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4页 |
| 第1章 文献综述 | 第8-18页 |
| 1.1 引言 | 第8页 |
| 1.2 乳酸乳球菌的耐酸机制分析 | 第8-10页 |
| 1.3 非编码小RNA的研究进展 | 第10-13页 |
| 1.4 sRNA靶基因的筛选与鉴定方法 | 第13-14页 |
| 1.5 sRNA的核心调控区 | 第14-15页 |
| 1.6 乳酸菌中的敲除方法 | 第15-16页 |
| 1.7 本论文的研究内容 | 第16-18页 |
| 第2章 酸耐受相关的sRNAs015的鉴定 | 第18-42页 |
| 2.1 引言 | 第18页 |
| 2.2 实验材料 | 第18-23页 |
| 2.2.1 实验菌株和培养基 | 第18-19页 |
| 2.2.2 实验药品和试剂 | 第19-22页 |
| 2.2.3 实验仪器和设备 | 第22-23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-33页 |
| 2.3.1 RNA的提取 | 第23页 |
| 2.3.2 Northernblot杂交 | 第23-24页 |
| 2.3.3 质粒的提取 | 第24页 |
| 2.3.4 目的片段与载体的酶切回收及连接 | 第24-25页 |
| 2.3.5 敲除载体的构建及sRNAs015的敲除 | 第25-29页 |
| 2.3.6 乳酸乳球菌基因组的提取 | 第29页 |
| 2.3.7 大肠杆菌TG1感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| 2.3.8 感受态细胞化学法转化 | 第30页 |
| 2.3.9 转化子的筛选与验证 | 第30页 |
| 2.3.10 乳酸乳球菌F44感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2.3.11 电击转化乳酸菌感受态细胞及转化子的筛选与验证 | 第31页 |
| 2.3.12 耐酸性检测 | 第31-32页 |
| 2.3.13 生长曲线及发酵液pH的测定 | 第32页 |
| 2.3.14 nisin效价的检测 | 第32-33页 |
| 2.4 实验结果 | 第33-41页 |
| 2.4.1 northernblot杂交验证sRNAs015存在 | 第33-34页 |
| 2.4.2 温敏型载体敲除sRNAs015 | 第34-37页 |
| 2.4.3 原始野生型菌株与缺失菌株耐酸性验证 | 第37-38页 |
| 2.4.4 原始野生型菌株与缺失菌株生存能力的分析 | 第38-39页 |
| 2.4.5 原始野生型菌株与缺失菌株产酸能力分析 | 第39-40页 |
| 2.4.6 nisin产量分析 | 第40-41页 |
| 2.5 小结 | 第41-42页 |
| 第3章 耐酸性sRNAs015靶基因预测与核心调控区预测 | 第42-62页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料 | 第42页 |
| 3.3 实验方法 | 第42-45页 |
| 3.3.1 靶标预测 | 第42-43页 |
| 3.3.2 靶基因筛选 | 第43-44页 |
| 3.3.3 sRNA结合区域分析 | 第44-45页 |
| 3.4 实验结果 | 第45-61页 |
| 3.4.1 靶标预测结果 | 第45-58页 |
| 3.4.2 靶标基因筛选分析 | 第58-59页 |
| 3.4.3 s015核心调控区分析 | 第59-61页 |
| 3.5 小结 | 第61-62页 |
| 第4章 后续靶标的验证与机理分析 | 第62-74页 |
| 4.1 引言 | 第62页 |
| 4.2 实验材料 | 第62-63页 |
| 4.2.1 实验菌株与培养基 | 第62页 |
| 4.2.2 实验药品和试剂 | 第62-63页 |
| 4.3 实验方法 | 第63-69页 |
| 4.3.1 插入eGfp蛋白的靶标验证 | 第63-64页 |
| 4.3.2 qRT-PCR验证 | 第64-65页 |
| 4.3.3 qRT-PCR相对定量方法原理 | 第65-66页 |
| 4.3.4 大肠杆菌BL21感受态细胞的制备 | 第66-67页 |
| 4.3.5 融合eGfp基因的靶标验证 | 第67-69页 |
| 4.3.6 sRNA靶标验证菌株的荧光检测 | 第69页 |
| 4.4 实验结果 | 第69-72页 |
| 4.4.1 插入eGfp的体内靶标验证结果 | 第69-70页 |
| 4.4.2 qRT-PCR验证 | 第70-71页 |
| 4.4.3 融合eGfp靶标验证基因荧光值结果 | 第71-72页 |
| 4.5 小结 | 第72-74页 |
| 第5章 突变验证与功能分析 | 第74-88页 |
| 5.1 引言 | 第74页 |
| 5.2 实验材料 | 第74页 |
| 5.3 实验方法 | 第74-75页 |
| 5.3.1 RNA二级结构与结合区预测 | 第74页 |
| 5.3.2 突变片段的获得 | 第74-75页 |
| 5.3.3 对sRNA进行位点突变的融合验证 | 第75页 |
| 5.3.4 耐酸性检测 | 第75页 |
| 5.3.5 生长曲线及发酵液pH的测定 | 第75页 |
| 5.4 实验结果 | 第75-86页 |
| 5.4.1 s015二级结构分析 | 第75-77页 |
| 5.4.2 sRNA与靶标基因之间的相互作用分析 | 第77-80页 |
| 5.4.3 靶基因酸耐受性分析 | 第80-82页 |
| 5.4.4 过表达靶基因生存能力分析 | 第82-83页 |
| 5.4.5 过表达靶基因产酸能力分析 | 第83-84页 |
| 5.4.6 靶基因可能功能分析 | 第84-86页 |
| 5.5 小结 | 第86-88页 |
| 第6章 结论与展望 | 第88-90页 |
| 6.1 结论 | 第88-89页 |
| 6.2 展望 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-96页 |
| 附录 A 靶基因筛选软件源代码 | 第96-104页 |
| 附录 B sRNA结合区域分析软件源代码 | 第104-112页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第112-114页 |
| 致谢 | 第114页 |
