| 第一章 绪论 | 第1-42页 |
| 1．1 引言 | 第12页 |
| 1．2 ALA在农业、医学等领域的应用价值与前景展望 | 第12-17页 |
| 1．2．1 农业上的用途及作用机理 | 第12-15页 |
| 1．2．1．1 新型绿色除草剂 | 第13-14页 |
| 1．2．1．2 植物生长调节剂 | 第14页 |
| 1．2．1．3 无公害杀虫剂 | 第14-15页 |
| 1．2．2 医学领域的应用价值 | 第15-17页 |
| 1．3 5-氨基乙酰丙酸的稳定性 | 第17-19页 |
| 1．4 生物合成5-氨基乙酰丙酸的机理 | 第19-23页 |
| 1．4．1 碳四途径(Sheminpathway)ALA合成的调节机制 | 第19-21页 |
| 1．4．2 碳五途径(C5pathway)ALA合成的调节机制 | 第21-23页 |
| 1．4 生产5-氨基乙酰丙酸的方法 | 第23-28页 |
| 1．4．1 化学方法合成ALA | 第23-25页 |
| 1．4．1．1 以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺 | 第23页 |
| 1．4．1．2 以吡啶，糠醛等杂环物质的衍生物为反应原料 | 第23-24页 |
| 1．4．1．3 以乙酰丙酸或其衍生物为原料的合成工艺 | 第24-25页 |
| 1．4．2 生物法合成ALA | 第25-28页 |
| 1．4．2．1 诱变育种法 | 第26-27页 |
| 1．4．2．2 基因工程菌生产ALA | 第27-28页 |
| 1．5 重组大肠杆菌高密度培养概述 | 第28-30页 |
| 1．5．1 影响重组大肠杆菌的高密度培养因素 | 第29-30页 |
| 1．5．1．1 宿主菌特性 | 第29页 |
| 1．5．1．2 表达基因的调控 | 第29-30页 |
| 1．6 重组大肠杆菌分批发酵动力学研究进展 | 第30-32页 |
| 1．6．1 微生物发酵培养中的结构模型 | 第30页 |
| 1．6．2 微生物发酵培养中的非结构模型 | 第30-32页 |
| 1．7 本课题拟研究的内容 | 第32-33页 |
| 参考文献 | 第33-42页 |
| 第二章 材料与方法 | 第42-55页 |
| 2．1 实验材料 | 第42-43页 |
| 2．1．1 菌种和质粒 | 第42页 |
| 2．1．2 工具酶及试剂盒 | 第42页 |
| 2．1．3 培养基 | 第42-43页 |
| 2．1．3．1 大肠杆菌培养 | 第42-43页 |
| 2．1．3．2 放射形土壤杆菌的培养 | 第43页 |
| 2．1．3．3 类球红细菌的培养 | 第43页 |
| 2．1．4 主要仪器 | 第43页 |
| 2．2 实验方法 | 第43-48页 |
| 2．2．1 分子克隆相关实验 | 第43页 |
| 2．2．2 A．radiobacterzju-0121基因组的提取 | 第43-44页 |
| 2．2．3 大肠杆菌菌体浓度测定 | 第44页 |
| 2．2．4 大肠杆菌菌体干重测定 | 第44页 |
| 2．2．5 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取 | 第44-45页 |
| 2．2．6 蛋白浓度测定 | 第45页 |
| 2．2．7 SDS-PAGE电泳 | 第45页 |
| 2．2．8 还原糖浓度测定 | 第45-46页 |
| 2．2．9 葡萄糖浓度的测定 | 第46页 |
| 2．2．10 ALA合成酶比活性的测定 | 第46页 |
| 2．2．11 发酵液中有机酸的测定 | 第46-48页 |
| 2．3 5-氨基乙酰丙酸的分析方法 | 第48-54页 |
| 2．3．1 化学显色法 | 第48-49页 |
| 2．3．2 反相高效液相色谱柱前衍生法 | 第49-54页 |
| 2．3．2．1 反应试剂配制 | 第49-50页 |
| 2．3．2．2 样品的制备 | 第50页 |
| 2．3．2．3 衍生方法的确定 | 第50-52页 |
| 2．3．2．4 色谱条件的确定 | 第52页 |
| 2．3．2．5 标准曲线的绘制 | 第52页 |
| 2．3．2．6 样品测试、与分光光度法的比较、回收率检测 | 第52-53页 |
| 2．3．2．7 方法重现性 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-55页 |
| 第三章 含5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的重组菌的构建 | 第55-73页 |
| 3．1 引言 | 第55页 |
| 3．2 材料和方法 | 第55-60页 |
| 3．2．1 质粒 | 第55-58页 |
| 3．2．2 菌株和培养基 | 第58页 |
| 3．2．3 酶和试剂盒 | 第58页 |
| 3．2．4 质粒提取和转化 | 第58-59页 |
| 3．2．4．1 质粒抽提 | 第59页 |
| 3．2．4．2 感受态细胞的制备和质粒转化 | 第59页 |
| 3．2．5 5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)基因的克隆与重组质粒的构建 | 第59-60页 |
| 3．2．5．1 放射形土壤杆菌与类球红细菌基因组的提取 | 第59页 |
| 3．2．5．2 聚合酶链式反应获得5-氨基乙酰丙酸合成酶的基因 | 第59-60页 |
| 3．2．6 菌体培养及酶蛋白表达 | 第60页 |
| 3．3 结果与讨论 | 第60-70页 |
| 3．3．1 5-氨基乙酰丙酸合成酶的序列分析 | 第60-62页 |
| 3．3．2 宿主细胞及质粒选择的原则 | 第62-63页 |
| 3．3．3 融合His．Tag对来源于类球红细菌的hemA基因表达ALAS和ALA合成的影响 | 第63-66页 |
| 3．3．4 来源于A．radiobacter和R．sphaeroides的hemA基因对重组菌ALAS和ALA合成的影响 | 第66-68页 |
| 3．3．5 质粒和宿主细胞对来源于A．radiobacr的hemA基因表达的影响 | 第68-70页 |
| 3．4 小结 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-73页 |
| 第四章 重组菌生产5-氨基乙酰丙酸发酵条件的初步研究 | 第73-101页 |
| 4．1 引言 | 第73页 |
| 4．2 材料和方法 | 第73-74页 |
| 4．2．1 实验材料 | 第73-74页 |
| 4．2．1．1 重组菌E．coli BL21(DE3) (pE728-A．R-hemA)的培养 | 第73页 |
| 4．2．1．2 试剂 | 第73-74页 |
| 4．2．1．3 实验仪器 | 第74页 |
| 4．2．2 实验方法 | 第74页 |
| 4．2．2．1 表达条件的优化 | 第74页 |
| 4．3 实验结果与讨论 | 第74-97页 |
| 4．3．1 培养基的优化 | 第74-75页 |
| 4．3．2 诱导条件的选择 | 第75-82页 |
| 4．3．2．1 诱导时机的选择 | 第76-78页 |
| 4．3．2．2 诱导剂浓度 | 第78-80页 |
| 4．3．2．3 诱导温度 | 第80-81页 |
| 4．3．2．4 诱导后的发酵时间 | 第81-82页 |
| 4．3．3 正交实验 | 第82-84页 |
| 4．3．4 前体添加量的优化 | 第84-87页 |
| 4．3．4．1 添加甘氨酸对菌体生长和ALA合成的影响 | 第84-86页 |
| 4．3．4．2 琥珀酸的添加量对菌体生长和ALA合成的影响 | 第86-87页 |
| 4．3．4．3 钠离子对菌体生长和胞外ALA积累的影响 | 第87页 |
| 4．3．5 摇瓶装液量对菌体生长和ALA合成的影响 | 第87-89页 |
| 4．3．6 初始葡萄糖浓度对ALA产量的影响 | 第89-91页 |
| 4．3．7 ALA脱水酶抑制剂对工程菌生长和ALA合成的影响 | 第91-95页 |
| 4．3．7．1 乙酰丙酸对工程菌生长和ALA合成的影响 | 第91-94页 |
| 4．3．7．2 D-葡萄糖对工程菌生长和ALA合成的影响 | 第94-95页 |
| 4．3．8 乳糖作为诱导剂对ALA合成酶表达及ALA合成的影响 | 第95-97页 |
| 4．4 小结 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-101页 |
| 第五章 5-氨基乙酰丙酸的发酵放大及其动力学研究 | 第101-122页 |
| 5．1 引言 | 第101-102页 |
| 5．2 材料和方法 | 第102-103页 |
| 5．2．1 菌株 | 第102-103页 |
| 5．2．2 种子培养基 | 第103页 |
| 5．2．3 发酵培养基 | 第103页 |
| 5．2．4 培养条件 | 第103页 |
| 5．2．4．1 种子培养条件 | 第103页 |
| 5．2．4．2 摇瓶发酵培养条件 | 第103页 |
| 5．2．4．3 发酵罐分批发酵条件 | 第103页 |
| 5．2．5 分析方法 | 第103页 |
| 5．2．6 实验主要仪器 | 第103页 |
| 5．3 结果与讨论 | 第103-119页 |
| 5．3．1 影响重组菌罐上培养的各因素的优化 | 第103-108页 |
| 5．3．1．1 pH值对发酵过程中菌体生长和ALA合成的影响 | 第103-105页 |
| 5．3．1．2 葡萄糖浓度对发酵过程中菌体生长和ALA合成的影响 | 第105-106页 |
| 5．3．1．3 溶氧对发酵过程中菌体生长和ALA合成的影响 | 第106-108页 |
| 5．3．2 5-氨基乙酰丙酸分批发酵动力学 | 第108-114页 |
| 5．3．3 重组菌的分批补料培养产ALA的研究 | 第114-119页 |
| 5．3．3．1 ALA合成前体分批补料培养 | 第115-116页 |
| 5．3．3．2 氮源影响及葡萄糖和甘氨酸分批补料及流加培养 | 第116-119页 |
| 5．4 小结 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-122页 |
| 第六章 发酵液中5-氨基乙酰丙酸稳定性的研究 | 第122-130页 |
| 6．1 引言 | 第122页 |
| 6．2 材料和方法 | 第122页 |
| 6．2．1 实验材料 | 第122页 |
| 6．2．2 实验方法 | 第122页 |
| 6．2．3 实验设备 | 第122页 |
| 6．3 实验结果与讨论 | 第122-127页 |
| 6．3．1 发酵液中不同ALA初始浓度的稳定性研究 | 第122-123页 |
| 6．3．2 温度对发酵液中ALA稳定性的影响 | 第123-124页 |
| 6．3．3 pH值对ALA稳定性的影响 | 第124-125页 |
| 6．3．4 溶氧对ALA稳定性的影响 | 第125-127页 |
| 6．3．5 光强对ALA稳定性的影响 | 第127页 |
| 6．4 小结 | 第127-129页 |
| 参考文献 | 第129-130页 |
| 第七章 结论与展望 | 第130-134页 |
| 7．1 结论 | 第130-132页 |
| 7．2 展望 | 第132-134页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第134-135页 |
| 致谢 | 第135-136页 |
