| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-27页 |
| 1.1 食源性疾病危害概述 | 第13页 |
| 1.2 食源性致病菌检测技术概况 | 第13-18页 |
| 1.2.1 传统检测法 | 第14页 |
| 1.2.2 免疫学方法 | 第14-15页 |
| 1.2.3 分子生物学检测方法 | 第15-18页 |
| 1.3 本研究使用的检测技术 | 第18-24页 |
| 1.3.1 依赖于解旋酶的核酸等温扩增法 | 第18-21页 |
| 1.3.2 高分辨率熔解曲线分析法 | 第21-24页 |
| 1.4 立项依据 | 第24-25页 |
| 1.5 主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 HRM-real time PCR体系的建立及优化 | 第27-42页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料与设备 | 第27-28页 |
| 2.2.1 试验菌株 | 第27页 |
| 2.2.2 主要试剂和培养基 | 第27页 |
| 2.2.3 仪器与设备 | 第27-28页 |
| 2.3 实验及分析方法 | 第28-32页 |
| 2.3.1 菌种的保藏及菌株的培养 | 第28页 |
| 2.3.2 菌体DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.3.4 引物的设计与筛选 | 第29-30页 |
| 2.3.5 单重HRM-real time PCR反应体系的建立 | 第30页 |
| 2.3.6 多重HRM-real time PCR反应体系的建立及优化 | 第30-32页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第32-39页 |
| 2.4.1 引物的设计 | 第32-33页 |
| 2.4.2 单重HRM-real time PCR反应体系的建立 | 第33页 |
| 2.4.3 多重HRM-real time PCR反应体系的建立及优化 | 第33-39页 |
| 2.5 讨论 | 第39-41页 |
| 2.5.1 关于竞争性抑制 | 第39-40页 |
| 2.5.2 T_m值的界定问题 | 第40-41页 |
| 2.6 本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 多重HRM-real time PCR检测方法的评估 | 第42-60页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料与设备 | 第42-43页 |
| 3.2.1 试验菌株 | 第42页 |
| 3.2.2 主要试剂和培养基 | 第42页 |
| 3.2.3 样品 | 第42-43页 |
| 3.2.4 仪器与设备 | 第43页 |
| 3.3 实验及分析方法 | 第43-45页 |
| 3.3.1 菌种的保藏及菌株的培养 | 第43页 |
| 3.3.2 菌体DNA的提取 | 第43页 |
| 3.3.3 多重HRM-real time PCR反应体系的特异性试验 | 第43页 |
| 3.3.4 多重HRM-real time PCR反应体系的敏感性试验 | 第43-44页 |
| 3.3.5 多重HRM-real time PCR反应体系试验间和试验内稳定性试验 | 第44页 |
| 3.3.6 多重HRM real-time PCR体系同时检测人工染菌食品样本 | 第44-45页 |
| 3.3.7 天然染菌样本的抽样检测 | 第45页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第45-57页 |
| 3.4.1 多重HRM-real time PCR反应体系的特异性 | 第45页 |
| 3.4.2 多重HRM-real time PCR反应体系的灵敏度 | 第45-53页 |
| 3.4.3 多重HRM real-time PCR体系的重复性 | 第53-54页 |
| 3.4.4 多重HRM real-time PCR体系检测人工染菌食品样本 | 第54-55页 |
| 3.4.5 多重HRM real-time PCR体系对天然染菌猪肉样本的检测 | 第55-57页 |
| 3.5 讨论 | 第57-59页 |
| 3.5.1 影响T_m值的因素 | 第57-58页 |
| 3.5.2 HRM real-time PCR体系的灵敏度 | 第58-59页 |
| 3.5.3 T_m值的比较 | 第59页 |
| 3.6 本章小结 | 第59-60页 |
| 第四章 耐热解旋酶Tte-uvrD粗酶液的制备及活性的初步评估 | 第60-86页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 实验材料与设备 | 第60-63页 |
| 4.2.1 试验菌株 | 第60页 |
| 4.2.2 样品、试剂和培养基 | 第60-63页 |
| 4.3 实验及分析方法 | 第63-75页 |
| 4.3.1 菌种的保藏、菌株的培养及菌体DNA的提取 | 第63页 |
| 4.3.2 试剂的配置 | 第63-66页 |
| 4.3.3 Tte-uvrd酶的克隆 | 第66-72页 |
| 4.3.4 Tte-uvrd酶的诱导表达 | 第72-73页 |
| 4.3.5 粗酶液的制备 | 第73页 |
| 4.3.6 Tte-UvrD粗酶液活性的初步评估 | 第73-75页 |
| 4.4 结果与分析 | 第75-83页 |
| 4.4.1 目的基因tte-uvrd的扩增及目的片段的纯化 | 第75-76页 |
| 4.4.2 阳性重组子质粒DNA鉴定 | 第76-78页 |
| 4.4.3 DNA的浓度及纯度测定 | 第78-79页 |
| 4.4.4 粗酶液的制备 | 第79-81页 |
| 4.4.5 粗酶液活性初步评估 | 第81-83页 |
| 4.5 讨论 | 第83-85页 |
| 4.5.1 制备高活性Tte-uvrD粗酶液的意义 | 第83页 |
| 4.5.2 高活性粗酶液的制备要点 | 第83-84页 |
| 4.5.3 控制影响分光光度计读数的因素 | 第84-85页 |
| 4.6 本章小结 | 第85-86页 |
| 第五章 HRM-tHDA单重检测体系的建立及评估 | 第86-96页 |
| 5.1 引言 | 第86页 |
| 5.2 实验材料与设备 | 第86-87页 |
| 5.2.1 试验菌株 | 第86页 |
| 5.2.2 样品 | 第86页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第86页 |
| 5.2.4 仪器与设备 | 第86-87页 |
| 5.3 实验方法 | 第87-89页 |
| 5.3.1 菌种的保藏、菌株的培养及菌体DNA的提取 | 第87页 |
| 5.3.2 单重HRM-tHDA体系的建立 | 第87页 |
| 5.3.3 单重HRM-tHDA反应体系的评估 | 第87-88页 |
| 5.3.4 单重HRM-tHDA体系检测人工染菌食品样本中的致病菌 | 第88-89页 |
| 5.3.5 单重HRM-tHDA体系应用于天然染菌样本的抽样检测 | 第89页 |
| 5.4 实验结果与分析 | 第89-94页 |
| 5.4.1 单重HRM-tHDA检测三种目标菌 | 第89-90页 |
| 5.4.2 单重HRM-tHDA的特异性 | 第90-91页 |
| 5.4.3 单重HRM-tHDA体系的灵敏性试验 | 第91-92页 |
| 5.4.4 单重HRM-tHDA体系的重复性性试验 | 第92-93页 |
| 5.4.5 单重HRM-tHDA体系用于检测人工染菌猪肉样本中的致病菌 | 第93页 |
| 5.4.6 单重HRM-tHDA体系用于检测市售猪肉样品中的致病菌 | 第93-94页 |
| 5.5 讨论 | 第94-95页 |
| 5.5.1 HRM-real time PCR与HRM-tHDA体系的对比 | 第94页 |
| 5.5.2 HRM-tHDA单重检测体系建立的意义 | 第94-95页 |
| 5.6 小结 | 第95-96页 |
| 结论与展望 | 第96-101页 |
| 一. 结论 | 第96-99页 |
| 二. 课题创新性阐述 | 第99-100页 |
| 三. 展望 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-112页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 附件 | 第114页 |
