| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-20页 |
| 1.1 胰酶的基因工程研究 | 第10-13页 |
| 1.1.1 大肠杆菌表达系统 | 第10-11页 |
| 1.1.2 酵母表达系统 | 第11-13页 |
| 1.2 生物酶热稳定性提高的策略 | 第13-19页 |
| 1.2.1 蛋白质理性设计与半理性设计 | 第14-16页 |
| 1.2.2 提高生物酶稳定性的常规策略 | 第16页 |
| 1.2.3 引入二硫键和脯氨酸 | 第16-17页 |
| 1.2.4 对柔性loop区域进行改造 | 第17页 |
| 1.2.5 糖基化 | 第17-19页 |
| 1.3 本研究的设计思路 | 第19-20页 |
| 第2章 删除突变菌株的获得 | 第20-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-23页 |
| 2.1.1 菌株与载体 | 第20页 |
| 2.1.2 试剂盒、工具酶及主要生化试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.3 溶液及培养基配置 | 第21-22页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第22-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-34页 |
| 2.2.1 组氨酸活性位点邻近的Ω-loop结构的柔性预测 | 第23-24页 |
| 2.2.2 删除突变的构建 | 第24-28页 |
| 2.2.3 表达载体的提取及毕赤酵母GS115感受态转化 | 第28-31页 |
| 2.2.4 G418抗性梯度培养及表型鉴定 | 第31-33页 |
| 2.2.5 突变毕赤酵母菌株的诱导表达及SDA-PAGE分析 | 第33-34页 |
| 2.3 实验结果及讨论 | 第34-40页 |
| 2.3.1 Ω-loop结构的柔性预测分析 | 第34-36页 |
| 2.3.2 删除突变体的获得 | 第36-37页 |
| 2.3.3 突变载体的提取结果 | 第37页 |
| 2.3.4 G418抗性梯度筛选及基因表型的鉴定分析 | 第37-39页 |
| 2.3.5 突变型菌株诱导表达的结果 | 第39-40页 |
| 2.4 本章小结 | 第40-42页 |
| 第3章 突变型胰酶活性和稳定性的测定 | 第42-50页 |
| 3.1 实验材料 | 第42页 |
| 3.1.1 主要生化试剂 | 第42页 |
| 3.1.2 溶液的配置 | 第42页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第42页 |
| 3.2 实验方法 | 第42-44页 |
| 3.2.1 胰蛋白酶的酶活测定 | 第42-43页 |
| 3.2.2 热稳定性的测定 | 第43-44页 |
| 3.2.3 野生型和突变型胰蛋白酶最适温度的测定 | 第44页 |
| 3.3 实验结果及讨论 | 第44-48页 |
| 3.3.1 删除突变的动力学稳定性分析 | 第44-46页 |
| 3.3.2 圆二色光谱分析 | 第46-47页 |
| 3.3.3 突变型胰蛋白酶最适温度的确定 | 第47-48页 |
| 3.4 本章小结 | 第48-50页 |
| 第4章 糖基化突变菌株的获得 | 第50-58页 |
| 4.1 实验材料 | 第50页 |
| 4.1.1 菌种、试剂盒、生化试剂及主要仪器 | 第50页 |
| 4.2 实验方法 | 第50-53页 |
| 4.2.1 糖基化位点的设计与改造 | 第50-53页 |
| 4.2.2 突变型猪源胰蛋白酶菌株的表达 | 第53页 |
| 4.3 实验结果及分析 | 第53-56页 |
| 4.3.1 突变位点的分析及突变型菌株的获得 | 第53-55页 |
| 4.3.2 突变型胰蛋白酶菌株的表达结果 | 第55-56页 |
| 4.4 本章小结 | 第56-58页 |
| 第5章 野生型与突变型胰蛋白酶热稳定性和活性比较 | 第58-66页 |
| 5.1 实验材料 | 第58页 |
| 5.1.1 主要生化试剂 | 第58页 |
| 5.1.2 溶液的配置 | 第58页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第58页 |
| 5.2 实验方法 | 第58-60页 |
| 5.2.1 胰蛋白酶的酶活测定 | 第58页 |
| 5.2.2 野生型及突变型胰蛋白酶的动力学稳定性的测定 | 第58-59页 |
| 5.2.3 野生型和突变型胰蛋白酶最适温度的测定 | 第59页 |
| 5.2.4 去糖基化突变型胰蛋白酶热稳定性及最适温度的测定 | 第59-60页 |
| 5.3 结果与分析 | 第60-64页 |
| 5.3.1 糖基化突变胰蛋白酶的动力学稳定性分析 | 第60-61页 |
| 5.3.2 突变型胰蛋白酶的最适温度的确定 | 第61-62页 |
| 5.3.3 去糖基化突变型胰蛋白酶热稳定性的测定及最适温度的确定 | 第62-64页 |
| 5.4 本章小结 | 第64-66页 |
| 第6章 结论与展望 | 第66-68页 |
| 6.1 结论 | 第66页 |
| 6.2 展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-77页 |
| 发表论文及参加科研情况 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
