| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-17页 |
| 1.1 黑曲霉 α-葡萄糖苷酶 | 第11-14页 |
| 1.1.1 黑曲霉 α-葡萄糖苷酶的性质 | 第11-12页 |
| 1.1.2 黑曲霉 α-葡萄糖苷酶的生产应用 | 第12页 |
| 1.1.3 α-葡萄糖苷酶的存在对黑曲霉糖化酶生产应用的影响 | 第12-13页 |
| 1.1.4 黑曲霉 α-葡萄糖苷酶的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2 黑曲霉中 α-葡萄糖苷酶编码基因的研究 | 第14-15页 |
| 1.3 课题的立题依据 | 第15-16页 |
| 1.4 课题的主要研究内容 | 第16-17页 |
| 第二章 黑曲霉SH-2 菌株7个 α-葡萄糖苷酶基因敲除载体的构建 | 第17-46页 |
| 2.1 引言 | 第17-18页 |
| 2.2 实验材料与设备 | 第18-22页 |
| 2.2.1 质粒与菌种 | 第18页 |
| 2.2.2 主要实验材料 | 第18-19页 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 | 第19-20页 |
| 2.2.4 引物设计 | 第20-22页 |
| 2.3 实验方法 | 第22-31页 |
| 2.3.1 重叠PCR构建7个 α-葡萄糖苷酶基因敲除框 | 第22-27页 |
| 2.3.2 α-葡萄糖苷酶基因敲除框连接T载体后转化大肠杆菌Match1T1进行扩增 | 第27-29页 |
| 2.3.3 α-葡萄糖苷酶基因敲除质粒小量提取及酶切验证 | 第29-30页 |
| 2.3.4 α-葡萄糖苷酶基因敲除质粒大量提取及线性化处理 | 第30-31页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第31-45页 |
| 2.4.1 黑曲霉SH-2 中 α-葡萄糖苷酶编码基因及氨基酸序列简要分析 | 第31-33页 |
| 2.4.2 α-葡萄糖苷酶基因agdA敲除载体的构建 | 第33-35页 |
| 2.4.3 α-葡萄糖苷酶基因agdB敲除载体的构建 | 第35-37页 |
| 2.4.4 α-葡萄糖苷酶基因agdC敲除载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.4.5 α-葡萄糖苷酶基因agdD敲除载体的构建 | 第38-40页 |
| 2.4.6 α-葡萄糖苷酶基因agdE敲除载体的构建 | 第40-42页 |
| 2.4.7 α-葡萄糖苷酶基因agdF敲除载体的构建 | 第42-43页 |
| 2.4.8 α-葡萄糖苷酶基因agdG敲除载体的构建 | 第43-45页 |
| 2.5 本章小结 | 第45-46页 |
| 第三章 黑曲霉SH-2 菌株7个 α-葡萄糖苷酶基因多重敲除突变株的构建及酶活分析 | 第46-74页 |
| 3.1 引言 | 第46页 |
| 3.2 实验材料与设备 | 第46-51页 |
| 3.2.1 质粒与菌种 | 第46页 |
| 3.2.2 主要实验材料 | 第46-50页 |
| 3.2.3 引物设计 | 第50-51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-58页 |
| 3.3.1 无孢黑曲霉SH-2 的转化及 α-葡萄糖苷酶基因敲除转化子的筛选 | 第51-52页 |
| 3.3.2 α-葡萄糖苷酶基因敲除疑似转化子基因组的提取及PCR验证 | 第52-54页 |
| 3.3.3 α-葡萄糖苷酶基因敲除株RNA提取及相对荧光定量PCR（RT-qPCR）分析 | 第54-56页 |
| 3.3.4 筛选标记基因ANpyrG的去除 | 第56-57页 |
| 3.3.5 pNPG法测定 α-葡萄糖苷酶活性 | 第57-58页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第58-73页 |
| 3.4.1 ?agd B敲除株的构建及?agdB敲除株筛选标记基因ANpyrG的去除 | 第58-61页 |
| 3.4.2 ?agd BA敲除株的构建及?agdBA敲除株筛选标记基因ANpyrG的去除 | 第61-64页 |
| 3.4.3 ?agd BAE敲除株的构建及?agdBAE敲除株筛选标记基因ANpyrG的去除 | 第64-67页 |
| 3.4.4 ?agd BAEG敲除株的构建及?agdBAEG敲除株筛选标记基因ANpyrG的去除 | 第67-70页 |
| 3.4.5 α-葡萄糖苷酶基因agdF/agdC/agdD敲除株的构建 | 第70-72页 |
| 3.4.6 系列 α-葡萄糖苷酶基因多重敲除株的酶活比较 | 第72-73页 |
| 3.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 第四章 黑曲霉SH23 菌株中 α-葡萄糖苷酶基因agdA和agdB的敲除及过量表达比较 | 第74-93页 |
| 4.1 引言 | 第74页 |
| 4.2 实验材料和设备 | 第74-76页 |
| 4.2.1 质粒与菌种 | 第74页 |
| 4.2.2 主要实验材料 | 第74-75页 |
| 4.2.3 引物序列 | 第75-76页 |
| 4.3 实验方法 | 第76-80页 |
| 4.3.1 α-葡萄糖苷酶基因agdA和agdB表达载体的构建 | 第76-77页 |
| 4.3.2 无孢黑曲霉SH23 的转化及 α-葡萄糖苷酶基因agdA和agdB的敲除及过量表达转化子的筛选 | 第77页 |
| 4.3.3 α-葡萄糖苷酶基因agdA和agdB敲除及过量表达疑似转化子基因组的提取及PCR验证 | 第77-78页 |
| 4.3.4 pNPG法测定转化子 α-葡萄糖苷酶活性 | 第78-79页 |
| 4.3.5 SDS-PAGE检测 α-葡萄糖苷酶基因agdA和agdB过量表达情况 | 第79页 |
| 4.3.6 宿主菌SH-2/SH23 和agdB敲除株 Δagd B/3-Δagd B随葡萄糖浓度变化菌体生长情况 | 第79-80页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第80-91页 |
| 4.4.1 α-葡萄糖苷酶基因agdA敲除株 3-?agd A的构建与鉴定 | 第80-81页 |
| 4.4.2 α-葡萄糖苷酶基因agdB敲除株 3-?agd B的构建与鉴定 | 第81-83页 |
| 4.4.3 α-葡萄糖苷酶基因agdA过量表达株 3-agdA的构建与鉴定 | 第83-86页 |
| 4.4.4 α-葡萄糖苷酶基因agdB过量表达株 3-agdB的构建与鉴定 | 第86-89页 |
| 4.4.5 敲除株?agdA、?agdB及敲除株 3-?agdA、3-?agdB的酶活比较 | 第89页 |
| 4.4.6 过量表达株 3-agdA、3-agdB表达产物的SDS-PAGE分析及 α-葡萄糖苷酶活性比较 | 第89-90页 |
| 4.4.7 agdB敲除株发酵生长情况分析 | 第90-91页 |
| 4.5 本章小结 | 第91-93页 |
| 结论与展望 | 第93-95页 |
| 结论 | 第93-94页 |
| 展望 | 第94页 |
| 本论文创新之处 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-100页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第100-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 附件 | 第102页 |
