| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10页 |
| 第1章 绪论 | 第12-24页 |
| 1.1 碱性蛋白酶 | 第12-14页 |
| 1.1.1 产碱性蛋白酶菌株 | 第12页 |
| 1.1.2 碱性蛋白酶的性质 | 第12-13页 |
| 1.1.3 碱性蛋白酶的分类 | 第13页 |
| 1.1.4 碱性蛋白酶的功能与应用 | 第13-14页 |
| 1.1.5 碱性蛋白酶的应用现状 | 第14页 |
| 1.2 芽孢形成过程中的关键基因调控机制 | 第14-19页 |
| 1.2.1 芽孢形成的起始的关键基因调控机制 | 第14-18页 |
| 1.2.2 芽孢形成过程中的形态变化及基因调控 | 第18-19页 |
| 1.3 实验技术路线 | 第19-22页 |
| 1.3.1 upp反向筛选标记 | 第19-20页 |
| 1.3.2 无痕敲除技术 | 第20-21页 |
| 1.3.3 pKSV7质粒构建过程及其特点 | 第21-22页 |
| 1.4 立题背景与研究内容 | 第22-24页 |
| 1.4.1 立题背景 | 第22-23页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第23-24页 |
| 第2章 克劳氏芽孢杆菌生物学特性分析 | 第24-40页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料和仪器 | 第24-25页 |
| 2.2.1 菌种 | 第24页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第24页 |
| 2.2.3 引物 | 第24-25页 |
| 2.2.4 培养基 | 第25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-29页 |
| 2.3.1 菌种 16s鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.2 菌落形态与镜检形态测定 | 第26页 |
| 2.3.3 培养条件对产酶的影响 | 第26-28页 |
| 2.3.4 生长曲线的测定 | 第28-29页 |
| 2.3.5 芽孢生成率测定 | 第29页 |
| 2.3.6 氯霉素抗性测定 | 第29页 |
| 2.3.7 5-氟尿嘧啶抗性测定 | 第29页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第29-38页 |
| 2.4.1 16s菌种鉴定 | 第29-32页 |
| 2.4.2 菌落形态 | 第32-33页 |
| 2.4.3 培养条件对产酶的影响 | 第33-37页 |
| 2.4.3.1 发酵时间对菌株产酶的影响 | 第33-34页 |
| 2.4.3.2 培养初始pH值对菌株产酶的影响 | 第34页 |
| 2.4.3.3 培养温度对菌株产酶的影响 | 第34-35页 |
| 2.4.3.4 装液量对菌株产酶的影响 | 第35页 |
| 2.4.3.5 接种量对菌株产酶的影响 | 第35-37页 |
| 2.4.4 克劳氏芽孢杆菌生长曲线测定 | 第37页 |
| 2.4.5 芽孢形成率的测定 | 第37页 |
| 2.4.6 克劳氏芽孢杆菌 5-氟尿嘧啶测定 | 第37-38页 |
| 2.4.7 克劳氏芽孢杆菌氯霉素抗性 | 第38页 |
| 2.5 本章小结 | 第38-40页 |
| 第3章 克劳氏芽孢杆菌中upp基因的敲除 | 第40-60页 |
| 3.1 引言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料和仪器 | 第40-41页 |
| 3.2.1 菌种 | 第40页 |
| 3.2.2 引物 | 第40-41页 |
| 3.2.3 主要化学试剂 | 第41页 |
| 3.2.4 常用实际的配制 | 第41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-44页 |
| 3.3.1 upp基因敲除示意图 | 第41-43页 |
| 3.3.2 常规分子操作方法 | 第43页 |
| 3.3.3 化学转化法步骤 | 第43-44页 |
| 3.3.4 重组载体的转化及重组子的筛选 | 第44页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第44-57页 |
| 3.4.1 upp基因上下游同源臂的合成与扩增 | 第44-49页 |
| 3.4.1.1 上下游同源臂的扩增 | 第44-45页 |
| 3.4.1.2 上下游同源臂的连接 | 第45-49页 |
| 3.4.2 重组载体pKSV7-upp的构建 | 第49-51页 |
| 3.4.2.1 目的基因与载体pKSV7的连接 | 第49页 |
| 3.4.2.2 转化 | 第49-50页 |
| 3.4.2.3 菌落PCR验证 | 第50页 |
| 3.4.2.4 重组载体pKSV7-upp酶切验证 | 第50-51页 |
| 3.4.3 重组载体pKSV7-upp转化与重组子筛选 | 第51-53页 |
| 3.4.3.1 转化 | 第51页 |
| 3.4.3.2 转化子的验证 | 第51-53页 |
| 3.4.4 测序结果比对 | 第53-56页 |
| 3.4.5 Δupp菌株的upp抗性实验 | 第56-57页 |
| 3.5 本章小结 | 第57-60页 |
| 第4章 克劳氏芽孢杆菌spoOA基因的敲除 | 第60-72页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第60-61页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第60页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第60页 |
| 4.2.3 引物 | 第60-61页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第61-70页 |
| 4.3.1 spoOA基因敲除过程 | 第61-62页 |
| 4.3.2 spoOA上下游同源臂基因获取 | 第62-64页 |
| 4.3.2.1 spoOA上下游同源臂基因的扩增 | 第62页 |
| 4.3.2.2 目的基因的测序验证 | 第62-64页 |
| 4.3.3 载体pKSU与spoOA上下游同源臂的连接 | 第64-68页 |
| 4.3.3.1 载体pKSU与spoOA下游同源臂的分步酶切 | 第64-65页 |
| 4.3.3.2 下游同源臂与载体pKSU的连接 | 第65页 |
| 4.3.3.3 重组载体pKSU-spoOA_(downstream)的连接验证 | 第65-66页 |
| 4.3.3.4 重组载体pKSU-spoOA_(downstream)的分步酶切 | 第66-67页 |
| 4.3.3.5 spoOA上游同源臂的酶切 | 第67页 |
| 4.3.3.6 pKSU-spoOA_(downstream)- spoOA_(upstream)的连接验证 | 第67-68页 |
| 4.3.4 重组载体导入菌株△upp-克劳氏芽孢杆菌 | 第68页 |
| 4.3.5 ΔspoOA缺失菌株的筛选 | 第68-69页 |
| 4.3.6 克劳氏芽孢杆菌ΔspoOA-Δupp特性分析 | 第69-70页 |
| 4.4 本章小结 | 第70-72页 |
| 第5章 结论与展望 | 第72-74页 |
| 5.1 结论 | 第72-73页 |
| 5.2 展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 致谢 | 第80-82页 |
| 在学期间主要科研成果 | 第82页 |
