| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-23页 |
| 1.1 细菌来源的D-海因酶及酶学特性 | 第9-13页 |
| 1.1.1 D-海因酶的结构和性质 | 第9-11页 |
| 1.1.2 不同来源的D-海因酶的特点 | 第11-13页 |
| 1.2 N-氨甲酰水解酶 | 第13页 |
| 1.3 海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸 | 第13-17页 |
| 1.3.1 海因酶法 | 第14-15页 |
| 1.3.2 海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸 | 第15-17页 |
| 1.4 羟基丁酮诱导表达系统 | 第17-20页 |
| 1.4.1 acoABCL操纵子的结构 | 第18页 |
| 1.4.2 acoR基因与AcoR激活蛋白 | 第18-19页 |
| 1.4.3 sigL基因 | 第19页 |
| 1.4.4 acoABCL操纵子的表达调控机制 | 第19-20页 |
| 1.5 影响枯草芽孢杆菌芽孢形成的关键基因 | 第20-21页 |
| 1.5.1 枯草芽孢杆菌的芽孢形成机制 | 第20-21页 |
| 1.5.2 枯草芽孢杆菌的芽孢形成的关键基因 | 第21页 |
| 1.6 本文的研究目的和意义 | 第21-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-30页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.2 PCR引物与合成片段 | 第24-26页 |
| 2.1.3 主要药品 | 第26-28页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第28页 |
| 2.1.5 培养基 | 第28-29页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-42页 |
| 2.2.1 B. subtilis染色体DNA的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.2 CTAB法提取质粒 | 第31页 |
| 2.2.3 DNA片段的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.4 重叠PCR反应 | 第32-33页 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第33页 |
| 2.2.6 DNA的切胶纯化与回收 | 第33-34页 |
| 2.2.7 DNA的酶切反应 | 第34页 |
| 2.2.8 DNA的连接反应 | 第34-35页 |
| 2.2.9 B. subtilis的感受态转化 | 第35页 |
| 2.2.10 E. coli感受态的转化 | 第35页 |
| 2.2.11 超声法细胞破碎方法 | 第35-36页 |
| 2.2.12 茚三酮法检测D-对羟基苯甘氨酸 | 第36页 |
| 2.2.13 PDAB定性检测N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸 | 第36页 |
| 2.2.14 高压液相色谱测定D-对羟基苯甘氨酸 | 第36-37页 |
| 2.2.15 海因酶和氨甲酰水解酶总酶活的测定 | 第37-38页 |
| 2.2.16 DNA片段的合成与测序 | 第38页 |
| 2.2.17 基因的无标记修饰方法 | 第38页 |
| 2.2.18 菌种的保藏 | 第38-39页 |
| 2.2.19 细胞总RNA的提取 | 第39页 |
| 2.2.20 cDNA的合成和实时荧光定量PCR | 第39-41页 |
| 2.2.21 活菌计数及芽孢计数方法 | 第41-42页 |
| 第三章 结果与分析 | 第42-74页 |
| 3.1 D-海因酶的比较和选择 | 第42-48页 |
| 3.1.1 D-海因酶的比较 | 第42-44页 |
| 3.1.2 重组质粒pHCY和pHCS的构建 | 第44-47页 |
| 3.1.3 重组质粒的转化和海因酶活性比较 | 第47-48页 |
| 3.2 acoR和sigL基因过表达菌株的构建及对总酶活性的影响 | 第48-57页 |
| 3.2.1 acoR过表达菌株的构建 | 第49-51页 |
| 3.2.2 sigL过表达菌株的构建 | 第51-54页 |
| 3.2.3 acoR和sigL过表达菌株的构建 | 第54-56页 |
| 3.2.4 WD-3菌株acoR和sigL基因的相对表达水平 | 第56-57页 |
| 3.2.5 acoR和sigL基因过表达对总酶活性的影响 | 第57页 |
| 3.3 增加adc和sd1基因拷贝数对总酶活性的影响 | 第57-61页 |
| 3.3.1 高拷贝重组质粒pUCS的构建及转化 | 第57-60页 |
| 3.3.2 重组菌株的胞内聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第60-61页 |
| 3.4 sdp和skf的敲除及其对全细胞催化活性的影响 | 第61-67页 |
| 3.4.1 sdp基因的敲除 | 第61-64页 |
| 3.4.2 skf基因的敲除 | 第64-66页 |
| 3.4.3 sdp和skf基因的敲除对总酶活性的影响 | 第66-67页 |
| 3.5 芽孢形成缺陷对全细胞催化活性的影响 | 第67-74页 |
| 3.5.1 kinA基因的敲除 | 第67-70页 |
| 3.5.2 kinB基因的敲除 | 第70-72页 |
| 3.5.3 kinA和kinB基因缺陷的效应 | 第72-74页 |
| 第四章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 4.1 主要结论 | 第74页 |
| 4.2 创新点 | 第74-75页 |
| 4.3 展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
