| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-12页 |
| 1 引言 | 第12-19页 |
| ·研究背景 | 第12-16页 |
| ·不同来源的乳糖酶及其酶学特性 | 第12-13页 |
| ·乳糖酶水解乳糖作用机制 | 第13-14页 |
| ·乳糖酶国内外研究现状及其应用 | 第14-16页 |
| ·乳糖酶的表达系统 | 第16-18页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第16-17页 |
| ·甲醇营养型酵母表达系统 | 第17页 |
| ·乳酸菌表达系统 | 第17-18页 |
| ·可应用于重叠基因的真核表达策略 | 第18-19页 |
| ·双质粒载体的共表达 | 第18页 |
| ·KeX2-连接桥形成基因串联融合表达 | 第18-19页 |
| ·表达盒串联 | 第19页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第19页 |
| 2 乳糖酶基因的克隆及原核表达 | 第19-39页 |
| ·材料 | 第19-22页 |
| ·菌种和质粒 | 第19-20页 |
| ·工具酶和试剂 | 第20页 |
| ·实验仪器 | 第20页 |
| ·培养基和相关溶液配制 | 第20-21页 |
| ·所用引物序列 | 第21-22页 |
| ·方法 | 第22-30页 |
| ·卷曲乳杆菌B470基因组DNA的提取 | 第22页 |
| ·乳糖酶基因bg2-470的PCR扩增及重组质粒载体的构建 | 第22-26页 |
| ·保守区序列片段的获得 | 第22-24页 |
| ·TAIL-PCR扩增侧翼序列 | 第24-25页 |
| ·基因全长扩增 | 第25-26页 |
| ·乳糖酶基因bg2-470的扩增及重组质粒载体的构建 | 第26-27页 |
| ·乳糖酶基因bg2-470的序列分析 | 第27页 |
| ·乳糖酶基因bg2-470原核重组表达质粒的构建 | 第27-28页 |
| ·bg2-470基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第28-29页 |
| ·原核表达乳糖酶的纯化 | 第29-30页 |
| ·乳糖酶活力测定方法 | 第30页 |
| ·结果与分析 | 第30-38页 |
| ·乳糖酶基因序列比对及保守区简并引物设计 | 第30-31页 |
| ·卷曲乳杆菌乳糖酶基因bg2-470的克隆和鉴定 | 第31-32页 |
| ·乳糖酶基因bg2-470的核酸序列测序结果 | 第32-37页 |
| ·bg2-470基因在大肠杆菌中的表达 | 第37-38页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第37-38页 |
| ·酶活性的测定 | 第38页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第38页 |
| ·酶活力测定 | 第38页 |
| ·讨论 | 第38-39页 |
| ·小结 | 第39页 |
| 3 乳糖酶基因bg2-470在毕赤酵母中的表达 | 第39-55页 |
| ·材料 | 第39-40页 |
| ·菌株与质粒 | 第39-40页 |
| ·培养基 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·实验仪器 | 第40页 |
| ·方法 | 第40-48页 |
| ·根据共表达策略设计引物进行基因扩增并构建载体 | 第40-43页 |
| ·根据大小亚基二聚体串联策略设计引物进行基因扩增并构建载体 | 第43-46页 |
| ·根据表达盒串联策略设计引物进行基因扩增并构建载体 | 第46-47页 |
| ·酵母的感受态细胞制备 | 第47页 |
| ·重组质粒电击转化酵母 | 第47页 |
| ·共表达的二次转化 | 第47-48页 |
| ·重组酵母的初筛 | 第48页 |
| ·重组转化子的复筛 | 第48页 |
| ·结果与分析 | 第48-54页 |
| ·共表达策略设计引物进行基因扩增并构建载体 | 第48-49页 |
| ·根据大小亚基二聚体串联策略设计引物进行基因扩增并构建载体 | 第49-50页 |
| ·根据表达盒串联策略设计引物进行基因扩增并构建载体 | 第50-51页 |
| ·共表达策略转化酵母的二次转化 | 第51-52页 |
| ·三种表达策略转化的重组酵母的初筛 | 第52-53页 |
| ·重组转化子的复蹄 | 第53-54页 |
| ·讨论 | 第54-55页 |
| 4 高表达酵母菌株的发酵培养与蛋白纯化 | 第55-63页 |
| ·材料 | 第55页 |
| ·实验材料 | 第55页 |
| ·主要试剂 | 第55页 |
| ·实验仪器 | 第55页 |
| ·培养基 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-58页 |
| ·菌株的发酵培养 | 第55-57页 |
| ·蛋白微滤、超滤纯化 | 第57-58页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第58页 |
| ·离子交换层析纯化蛋白 | 第58页 |
| ·凝胶过滤层析纯化蛋白 | 第58页 |
| ·结果与分析 | 第58-62页 |
| ·GS115-EBS78与GS115-EBS86的发酵参数 | 第58-59页 |
| ·蛋白微滤、超滤纯化 | 第59页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳分析 | 第59-60页 |
| ·离子交换层析纯化蛋白 | 第60-61页 |
| ·凝胶过滤层析纯化蛋白 | 第61-62页 |
| ·BG2-470发酵产物的整体纯化效果 | 第62页 |
| ·讨论 | 第62-63页 |
| ·小结 | 第63页 |
| 5 真核表达乳糖酶蛋白BG2-470的酶学性质测定 | 第63-70页 |
| ·材料 | 第63页 |
| ·实验材料 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-65页 |
| ·乳糖酶样品的制备 | 第63页 |
| ·乳糖酶比活的测定 | 第63-64页 |
| ·蛋白含量标准曲线的绘制 | 第63-64页 |
| ·按照2.2.8乳糖酶活性测定程序测定待测样品的酶活力 | 第64页 |
| ·乳糖酶的最适pH测定 | 第64页 |
| ·乳糖酶的pH稳定性测定 | 第64页 |
| ·乳糖酶的最适温度测定 | 第64页 |
| ·乳糖酶的热稳定性测定 | 第64-65页 |
| ·金属离子和化学试剂对乳糖酶活性的影响 | 第65页 |
| ·乳糖酶的K_M和V_(MAX)的测定 | 第65页 |
| ·结果与分析 | 第65-70页 |
| ·乳糖酶比活的测定 | 第65-66页 |
| ·考马斯亮蓝法测定蛋白含量标准曲线的绘制 | 第65-66页 |
| ·比活的计算 | 第66页 |
| ·乳糖酶的最适pH | 第66-67页 |
| ·乳糖酶的pH稳定性 | 第67-68页 |
| ·乳糖酶的最适温度 | 第68页 |
| ·乳糖酶的热稳定性 | 第68-69页 |
| ·金属离子和化学试剂对乳糖酶活性的影响 | 第69页 |
| ·乳糖酶的K_M和V_(MAX)值 | 第69-70页 |
| ·讨论 | 第70页 |
| ·小结 | 第70页 |
| 6 全文结论 | 第70-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-76页 |
| 作者简介 | 第76页 |
