| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-19页 |
| ·腈水合酶及其研究简介 | 第8-14页 |
| ·腈水合酶的概述 | 第8-9页 |
| ·腈水合酶产生菌与表达 | 第9-10页 |
| ·腈水合酶的活性中心与催化机理 | 第10-11页 |
| ·腈水合酶的工业应用 | 第11-12页 |
| ·腈水合酶在生产中的主要问题与研究重点 | 第12-14页 |
| ·蛋白质工程在提高酶稳定性的应用 | 第14-16页 |
| ·蛋白质的理性设计 | 第14-15页 |
| ·蛋白质的半理性设计 | 第15页 |
| ·数据驱动的蛋白质设计 | 第15页 |
| ·同源重组蛋白质设计 | 第15-16页 |
| ·类弹性蛋白多肽标签简介 | 第16-18页 |
| ·本课题的立题依据和意义 | 第18页 |
| ·本课题的主要研究内容 | 第18-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-30页 |
| ·材料 | 第19-22页 |
| ·菌种与质粒 | 第19页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·主要仪器与设备 | 第19-20页 |
| ·主要溶液 | 第20-22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·NHase重组杂合酶的设计、克隆与表达 15 | 第22-26页 |
| ·NHase重组杂合酶的设计 | 第22页 |
| ·目的基因的克隆 | 第22-23页 |
| ·全质粒PCR法构建重组质粒 | 第23-24页 |
| ·Dpn I消化 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌高效感受态的制备 | 第25页 |
| ·热击转化方法 | 第25页 |
| ·NHase与其重组杂合酶的IPTG诱导表达 | 第25-26页 |
| ·NHase及其突变体的纯化与性质分析 | 第26-27页 |
| ·NHase及其突变体的纯化 | 第26页 |
| ·NHase与其突变体的酶活测定 | 第26页 |
| ·温度稳定性的测定 | 第26-27页 |
| ·酶的产物耐受性的测定 | 第27页 |
| ·酶动力学参数测定 | 第27页 |
| ·酶pH稳定性的测定 | 第27页 |
| ·NHase及其突变体的结构分析 | 第27-28页 |
| ·圆二色谱分析与热变性实验 | 第27页 |
| ·酶底物进出通道分析 | 第27-28页 |
| ·两种ELP标签的构建与NHase-ELP表达载体的构建 | 第28页 |
| ·NHase-ELP融合酶的纯化与性质测定 | 第28-30页 |
| ·相变温度的测定 | 第28-29页 |
| ·ITC纯化NHase-ELP融合酶 | 第29-30页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第30-46页 |
| ·提高NHase热稳定性的同源片段与重组位点的选择 | 第30-32页 |
| ·STAR(site-targeted recombination)分析 | 第30-31页 |
| ·分子动力学模拟分析 | 第31-32页 |
| ·野生型NHase与重组NHase突变体酶活及稳定性比较 | 第32-34页 |
| ·NHase及其突变体的表达 | 第32-33页 |
| ·NHase及突变体的酶活比较 | 第33页 |
| ·NHase及突变体酶动力学稳定性比较 | 第33-34页 |
| ·NHase及突变体酶的产物耐受性比较 | 第34页 |
| ·NHase与 3AB酶学性质比较 | 第34-36页 |
| ·野生型NHase与 3AB的Tm比较 | 第35页 |
| ·NHase与 3AB的pH稳定性比较 | 第35-36页 |
| ·NHase与 3AB的酶动力学比较 | 第36页 |
| ·野生型PpNHase与 3AB的结构分析与比较 | 第36-39页 |
| ·PpNHase与 3AB的结构比较 | 第36-38页 |
| ·同源片段交换对酶通道的影响 | 第38-39页 |
| ·类蛋白弹性标签(ELP)介导的腈水合酶快速纯化 | 第39-46页 |
| ·ELP([V5A2G3]-20 与[V]-20)标签的构建 | 第39-41页 |
| ·腈水合酶-ELP融合蛋白的表达以及相变温度的确定 | 第41-42页 |
| ·通过ITC纯化腈水合酶 | 第42-44页 |
| ·NHase-ELP与野生型腈水合酶的热稳定性比较 | 第44-46页 |
| 主要结论与展望 | 第46-48页 |
| 主要结论 | 第46页 |
| 展望 | 第46-48页 |
| 致谢 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-53页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第53页 |
