| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| ·胰岛素 | 第10-12页 |
| ·胰岛素简介 | 第10页 |
| ·重组胰岛素的生产工艺简介 | 第10-11页 |
| ·胰岛素前体到胰岛素的制备方法 | 第11页 |
| ·目前商品胰岛素简介 | 第11-12页 |
| ·大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母表达系统的比较 | 第12-13页 |
| ·毕赤酵母高效表达异源蛋白的策略 | 第13-18页 |
| ·重组毕赤酵母的构建 | 第13-14页 |
| ·提高目的基因的转录水平 | 第14-15页 |
| ·提高翻译水平 | 第15页 |
| ·增强分泌水平 | 第15-16页 |
| ·降低目的蛋白的降解 | 第16-18页 |
| ·甲醇表型宿主的选择 | 第18页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第18页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第18-20页 |
| 第二章 材料与方法 | 第20-31页 |
| ·菌株与质粒 | 第20页 |
| ·仪器与试剂 | 第20页 |
| ·仪器 | 第20页 |
| ·试剂 | 第20页 |
| ·培养基 | 第20-21页 |
| ·多拷贝重组毕赤酵母的构建 | 第21-28页 |
| ·表达载体的构建 | 第21-22页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第22页 |
| ·化学转化法 | 第22页 |
| ·菌落PCR | 第22-23页 |
| ·酵母感受态的制作 | 第23页 |
| ·表达载体线性化 | 第23页 |
| ·电穿孔转化法 | 第23-24页 |
| ·毕赤酵母基因组的提取 | 第24页 |
| ·表达载体整合鉴定 | 第24-25页 |
| ·发酵上清液总蛋白浓度的测定 | 第25页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 | 第25-26页 |
| ·重组毕赤酵母目的基因拷贝数的测定 | 第26-27页 |
| ·毕赤酵母总RNA的提取 | 第27页 |
| ·RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 | 第27-28页 |
| ·目的基因转录水平的测定 | 第28页 |
| ·培养方法 | 第28-29页 |
| ·抗性平板的筛选 | 第28页 |
| ·摇瓶诱导培养 | 第28-29页 |
| ·高密度发酵培养 | 第29页 |
| ·检测分析方法 | 第29-31页 |
| ·菌浓的测定 | 第29页 |
| ·干重的测定 | 第29页 |
| ·甘油浓度的测定 | 第29页 |
| ·甲醇浓度的测定 | 第29-30页 |
| ·目的蛋白的质谱鉴定 | 第30页 |
| ·胰岛素前体浓度的测定 | 第30-31页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第31-49页 |
| ·增加目的基因拷贝数提高人胰岛素前体产量 | 第31-39页 |
| ·表达载体与重组毕赤酵母的构建 | 第31-33页 |
| ·多拷贝重组毕赤酵母的制备与筛选 | 第33-34页 |
| ·重组毕赤酵母人胰岛素前体基因IP拷贝数的测定 | 第34-35页 |
| ·基因拷贝数对重组毕赤酵母过量表达人胰岛素前体的影响 | 第35-36页 |
| ·重组毕赤酵母目的基因转录水平的测定 | 第36-38页 |
| ·小结 | 第38-39页 |
| ·减缓目的蛋白降解提高人胰岛素前体产量 | 第39-44页 |
| ·目的蛋白降解情况的检测 | 第39-41页 |
| ·目的蛋白降解原因的研究 | 第41-42页 |
| ·减缓目的蛋白降解的研究 | 第42-44页 |
| ·小结 | 第44页 |
| ·高密度发酵条件的初步优化提高人胰岛素前体产量 | 第44-49页 |
| ·降低温度对人胰岛素前体产量的影响 | 第44-45页 |
| ·调整甲醇浓度对人胰岛素前体产量的影响 | 第45-46页 |
| ·补加胰蛋白胨对人胰岛素前体产量的影响 | 第46-47页 |
| ·小结 | 第47-49页 |
| 主要结论与展望 | 第49-51页 |
| 致谢 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 附录 作者在攻读硕士学位期间取得的学术成果 | 第57-58页 |
| 附图 | 第58-60页 |