| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 氨肽酶的概述 | 第9-12页 |
| 1.1.1 氨肽酶的来源 | 第9页 |
| 1.1.2 氨肽酶的分类 | 第9-10页 |
| 1.1.3 氨肽酶的应用 | 第10-11页 |
| 1.1.4 脯氨酸氨肽酶(PAP) | 第11-12页 |
| 1.2 氨肽酶的研究进展 | 第12-15页 |
| 1.2.1 氨肽酶国外研究进展 | 第12-14页 |
| 1.2.2 氨肽酶国内研究进展 | 第14-15页 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第15-16页 |
| 1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统概述 | 第15页 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌发酵优化策略 | 第15-16页 |
| 1.4 立题意义 | 第16-17页 |
| 1.5 本文研究内容 | 第17-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-27页 |
| 2.1 材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第18页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 培养基与溶液 | 第18-19页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-24页 |
| 2.2.1 细菌质粒提取 | 第19页 |
| 2.2.2 PAP基因的克隆 | 第19-20页 |
| 2.2.3 PCR产物与质粒双酶切 | 第20页 |
| 2.2.4 目的基因与载体的连接 | 第20页 |
| 2.2.5 重组质粒转化E.coliJM109感受态细胞及验证 | 第20页 |
| 2.2.6 重组质粒电转化B.subtilisWB600感受态细胞及验证 | 第20-21页 |
| 2.2.7 重组PAP的表达及鉴定 | 第21页 |
| 2.2.8 重组菌生长曲线的测定 | 第21页 |
| 2.2.9 重组菌培养基优化 | 第21页 |
| 2.2.10 植酸对产PAP的影响 | 第21页 |
| 2.2.11 摇瓶培养条件优化 | 第21-22页 |
| 2.2.12 提高胞外酶活的探索 | 第22页 |
| 2.2.13 5L发酵罐发酵优化 | 第22-23页 |
| 2.2.14 PAP的分离纯化 | 第23页 |
| 2.2.15 PAP酶学性质研究 | 第23页 |
| 2.2.16 PAP的冻干保护剂配方优化 | 第23页 |
| 2.2.17 PAP的储藏稳定性 | 第23页 |
| 2.2.18 PAP协同内外切蛋白酶制备脱苦大米肽 | 第23-24页 |
| 2.3 分析方法 | 第24-27页 |
| 2.3.1 PAP活力测定 | 第24页 |
| 2.3.2 蛋白质浓度的测定 | 第24页 |
| 2.3.3 菌体干重测定 | 第24页 |
| 2.3.4 还原糖含量测定 | 第24-25页 |
| 2.3.5 比生长速率及比产酶速率的分析 | 第25页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE分析 | 第25页 |
| 2.3.7 MALDI-TOF-MS/MS分析 | 第25页 |
| 2.3.8 CD分析 | 第25-26页 |
| 2.3.9 水解度(DH)测定 | 第26页 |
| 2.3.10 游离氨基酸含量测定 | 第26页 |
| 2.3.11 多肽分子量分布测定 | 第26页 |
| 2.3.12 RP-HPLC分析 | 第26-27页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第27-54页 |
| 3.1 重组脯氨酸氨肽酶B.subtilis的构建 | 第27-30页 |
| 3.1.1 重组质粒的构建及转化大肠杆菌 | 第27-28页 |
| 3.1.2 重组质粒转化B.subtilis WB600 | 第28-29页 |
| 3.1.3 重组B.subtilis产PAP的验证 | 第29页 |
| 3.1.4 MALDI-TOF-MS/MS鉴定 | 第29-30页 |
| 3.2 重组菌培养基优化 | 第30-36页 |
| 3.2.0 重组菌生长曲线 | 第30-31页 |
| 3.2.1 碳源种类的优化 | 第31页 |
| 3.2.2 碳源浓度的优化 | 第31-32页 |
| 3.2.3 氮源种类的优化 | 第32-33页 |
| 3.2.4 氮源浓度的优化 | 第33页 |
| 3.2.5 培养基组分的正交实验 | 第33-35页 |
| 3.2.6 植酸对PAP产量的影响 | 第35-36页 |
| 3.3 重组菌摇瓶培养条件优化 | 第36-38页 |
| 3.3.1 初始pH的影响 | 第36页 |
| 3.3.2 接种量的影响 | 第36-37页 |
| 3.3.3 装液量的影响 | 第37页 |
| 3.3.4 培养温度的影响 | 第37-38页 |
| 3.4 提高胞外PAP的策略 | 第38-39页 |
| 3.5 重组菌5L发酵罐发酵优化 | 第39-45页 |
| 3.5.1 搅拌转速对发酵过程的影响 | 第39-40页 |
| 3.5.2 pH对发酵过程的影响 | 第40-41页 |
| 3.5.3 温度对发酵过程的影响 | 第41-42页 |
| 3.5.4 分批发酵条件优化及验证 | 第42-44页 |
| 3.5.5 多次流加葡萄糖对B.subtilis产PAP的影响 | 第44-45页 |
| 3.6 PAP的分离纯化 | 第45-47页 |
| 3.6.1 胞外PAP的分离纯化 | 第45-46页 |
| 3.6.2 胞内PAP的分离纯化 | 第46页 |
| 3.6.3 PAP纯化结果分析 | 第46-47页 |
| 3.7 PAP酶学性质 | 第47-48页 |
| 3.8 提高PAP稳定性研究 | 第48-50页 |
| 3.8.1 PAP冻干保护剂组分优化 | 第48-49页 |
| 3.8.2 圆二色谱分析 | 第49-50页 |
| 3.8.3 PAP储藏稳定性 | 第50页 |
| 3.9 PAP与其他蛋白酶复配制备脱苦大米肽 | 第50-54页 |
| 主要结论与展望 | 第54-56页 |
| 主要结论 | 第54-55页 |
| 展望 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-64页 |
| 附录 | 第64-65页 |
