| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-14页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶概述 | 第8页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的来源 | 第8-9页 |
| ·人苯丙氨酸羟化酶基因的研究 | 第8-9页 |
| ·其他生物中苯丙氨酸羟化酶研究 | 第9页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的结构和催化、调节机制 | 第9-11页 |
| ·紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的序列及三级结构分析 | 第9-11页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的反应机制及活性调节方式 | 第11页 |
| ·提高蛋白质稳定性的方法 | 第11-12页 |
| ·本课题的意义和主要的研究内容 | 第12-14页 |
| ·本课题的立题依据及意义 | 第12-13页 |
| ·本课题的研究内容 | 第13-14页 |
| 第二章 材料与方法 | 第14-27页 |
| ·材料 | 第14-18页 |
| ·菌种、质粒与引物 | 第14-15页 |
| ·主要仪器与设备 | 第15-16页 |
| ·主要试剂 | 第16页 |
| ·培养基 | 第16页 |
| ·主要溶液 | 第16-18页 |
| ·SDS-PAGE 制备 | 第18页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的表达与纯化方法 | 第18-22页 |
| ·紫色色杆菌基因组 DNA 的提取 | 第18-19页 |
| ·质粒的提取 | 第19页 |
| ·PCR 引物设计 | 第19页 |
| ·pah 的 PCR 扩增反应体系与 PCR 反应条件 | 第19页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第19页 |
| ·大肠杆菌 JM109 和 BL21(DE3)高效感受态细胞的制备 | 第19-20页 |
| ·重组质粒的构建 | 第20页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞热击转化方法 | 第20-21页 |
| ·PCR 鉴定阳性重组质粒 | 第21页 |
| ·双酶切鉴定阳性重组质粒 | 第21页 |
| ·DNA 序列测定 | 第21页 |
| ·目的蛋白的诱导表达与优化 | 第21-22页 |
| ·盐析沉淀目的蛋白 | 第22页 |
| ·DEAE 离子交换柱纯化目的蛋白 | 第22页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的酶学性质分析 | 第22-24页 |
| ·酶活测定方法确立 | 第22-23页 |
| ·PAH 蛋白最适温度及温度稳定性的测定 | 第23-24页 |
| ·PAH 蛋白最适 pH 及 pH 稳定性的测定 | 第24页 |
| ·PAH 蛋白稳定性的测定 | 第24页 |
| ·重组酶反应动力学参数的测定 | 第24页 |
| ·提高苯丙氨酸羟化酶热稳定性的分子改造方法 | 第24-27页 |
| ·全质粒 PCR 扩增方法 | 第24-25页 |
| ·全质粒 PCR 产物转化大肠杆菌 | 第25页 |
| ·点突变结果验证及表达 | 第25-26页 |
| ·突变体热稳定性分析 | 第26页 |
| ·Ellman's 试剂比色法测定二硫键 | 第26-27页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第27-43页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的表达与纯化 | 第27-30页 |
| ·重组质粒 pET24a-pah 的构建 | 第27-28页 |
| ·PAH 重组蛋白的表达 | 第28-29页 |
| ·PAH 重组蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶酶学性质分析 | 第30-33页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的酶反应体系的优化 | 第30-31页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的最适温度及温度稳定性 | 第31-32页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的最适 pH 及 pH 稳定性 | 第32页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶蛋白稳定性研究 | 第32-33页 |
| ·苯丙氨酸羟化酶的酶动力学参数测定 | 第33页 |
| ·分子改造提高苯丙氨酸羟化酶的热稳定性 | 第33-43页 |
| ·基于谐波动力学分析选取脯氨酸突变点 | 第34-35页 |
| ·基于 Disulfide by Design 分析选取半胱氨酸突变点 | 第35-36页 |
| ·PAH 突变体蛋白的获得 | 第36-38页 |
| ·PAH 突变体蛋白稳定性分析 | 第38-41页 |
| ·突变体 PAH 蛋白酶动力学参数分析 | 第41-43页 |
| 主要结论与展望 | 第43-44页 |
| 致谢 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-48页 |
| 附录 1： PAH 蛋白纯化结果 | 第48页 |
| 附录 2：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第48页 |
