| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-22页 |
| ·前言 | 第10页 |
| ·糖基化对于蛋白药物的影响 | 第10-11页 |
| ·哺乳动物细胞内的糖基化过程 | 第11-14页 |
| ·影响重组蛋白糖基化形态的因素 | 第14-18页 |
| ·影响蛋白糖基化的内因 | 第14页 |
| ·影响蛋白糖基化的外因 | 第14-18页 |
| ·培养模式 | 第14-15页 |
| ·培养环境 | 第15-16页 |
| ·培养基添加物对于糖基化的影响 | 第16-18页 |
| ·蛋白糖基化形态的检测方法 | 第18-20页 |
| ·课题背景、目的及研究内容 | 第20-22页 |
| 第2章 工程CHO细胞株生产rhEPO的N-糖基化特点 | 第22-33页 |
| ·前言 | 第22页 |
| ·材料与方法 | 第22-28页 |
| ·试剂与设备 | 第22-23页 |
| ·方法 | 第23-28页 |
| ·CHO细胞的静置培养 | 第23页 |
| ·rhEPO唾液酸含量检测 | 第23-26页 |
| ·PNGase F酶处理rhEPO样品 | 第26页 |
| ·凝集素共沉淀方法检测培养上清中rhEPO糖链分枝末端唾液酸占有率 | 第26-27页 |
| ·乳酸脱氢酶(LDH)和唾液酸酶的活性测定 | 第27-28页 |
| ·结果与讨论 | 第28-31页 |
| ·培养过程中rhEPO糖基化水平的变化 | 第28页 |
| ·CHO细胞所生产rhEPO质量降低是由于N-糖链变化造成的 | 第28-29页 |
| ·CHO细胞所生产rhEPO质量降低是由于N-糖链末端的唾液酸占有率降低 | 第29-30页 |
| ·CHO细胞培养过程中细胞活性的变化 | 第30页 |
| ·CHO细胞培养过程中上清中唾液酸酶活性变化 | 第30-31页 |
| ·小结 | 第31-33页 |
| 第3章 灌注培养模式下CHO生产rhEPO的N-糖基化变化 | 第33-42页 |
| ·前言 | 第33-34页 |
| ·材料与方法 | 第34-36页 |
| ·材料与设备 | 第34页 |
| ·方法 | 第34-36页 |
| ·CHO细胞的灌注培养和产物纯化 | 第34-35页 |
| ·rhEPO的唾液酸含量测定 | 第35-36页 |
| ·结果与讨论 | 第36-41页 |
| ·培养上清中rhEPO蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| ·灌注培养过程中CHO细胞的生长和rhEPO蛋白生产 | 第37-39页 |
| ·灌注培养过程中rhEPO糖基化修饰的变化 | 第39-41页 |
| ·灌注培养CHO细胞培养上清中唾液酸酶活性变化 | 第41页 |
| ·小结 | 第41-42页 |
| 第4章 培养环境对CHO生产rhEPO的N-糖基化的影响 | 第42-54页 |
| ·前言 | 第42页 |
| ·材料和方法 | 第42-44页 |
| ·细胞株与试剂 | 第42页 |
| ·方法 | 第42-44页 |
| ·添加唾液酸类似物、金属离子和不同的短链脂肪酸培养CHO细胞 | 第43页 |
| ·细胞总RNA的抽提 | 第43页 |
| ·对RNA样品进行DNase消化和逆转录 | 第43-44页 |
| ·荧光定量PCR检测 | 第44页 |
| ·结果与讨论 | 第44-52页 |
| ·培养环境中添加唾液酸酶抑制剂对CHO细胞的影响 | 第44-48页 |
| ·添加唾液酸类似物对细胞活性的影响 | 第44-45页 |
| ·添加唾液酸类似物对胞外唾液酸酶活性的抑制作用 | 第45-46页 |
| ·添加唾液酸类似物对CHO细胞所生产rhEPO的糖基化的影响 | 第46-47页 |
| ·金属离子对CHO细胞唾液酸酶活性的抑制作用 | 第47页 |
| ·不同金属离子对CHO细胞活性的影响 | 第47-48页 |
| ·不同短链脂肪酸对CHO生产蛋白过程的影响 | 第48-52页 |
| ·正丁酸钠对细胞生长的影响 | 第48页 |
| ·添加正丁酸钠对CHO唾液酸酶表达水平的影响 | 第48-49页 |
| ·CHO培养过程中添加正丁酸钠对rhEPO唾液酸含量的影响 | 第49-50页 |
| ·其他的短链脂肪酸对CHO细胞生产rhEPO蛋白的作用 | 第50-52页 |
| ·小结 | 第52-54页 |
| 第5章 结论与展望 | 第54-56页 |
| ·主要结论 | 第54页 |
| ·展望 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
