| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| ·延胡索酸简介 | 第10-12页 |
| ·延胡索酸及其用途 | 第10页 |
| ·延胡索酸的生产现状和方法 | 第10-12页 |
| ·酿酒酵母生产羧酸代谢工程策略 | 第12-15页 |
| ·构建丙酮酸库- 蓄流 | 第12-13页 |
| ·构建羧酸的积累途径- 引流 | 第13-14页 |
| ·强化丙酮酸的羧化反应- 开阀 | 第14-15页 |
| ·国内外研究进展 | 第15页 |
| ·胞质还原途径 | 第15页 |
| ·线粒体氧化途径 | 第15页 |
| ·代谢工程在工业生物技术领域的应用 | 第15-16页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第16-20页 |
| ·代谢工程改造 S. cerevisiae 生产延胡索酸存在的问题 | 第16-17页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第17-20页 |
| 第二章 调控硫胺素代谢构建丙酮酸库 | 第20-30页 |
| ·引言 | 第20-21页 |
| ·材料与方法 | 第21-24页 |
| ·菌株和质粒 | 第21页 |
| ·试剂和仪器 | 第21-22页 |
| ·培养基与培养条件 | 第22页 |
| ·分子生物学操作 | 第22-24页 |
| ·代谢物分析 | 第24页 |
| ·酶活测定方法 | 第24页 |
| ·结果 | 第24-28页 |
| ·单独敲除 THI2 和 THI3 基因对丙酮酸代谢的影响 | 第24-25页 |
| ·硫胺素浓度对突变株发酵特性的影响 | 第25页 |
| ·丙酮酸脱羧酶酶活分析 | 第25-26页 |
| ·THI2 基因调控作用的证实 | 第26-27页 |
| ·THI2 缺陷型菌株分批发酵实验 | 第27-28页 |
| ·讨论 | 第28-29页 |
| ·丙酮酸积累原因分析 | 第28页 |
| ·THI2 缺失对生长的影响 | 第28页 |
| ·THI2 缺失后胞内氧化还原平衡的分析 | 第28-29页 |
| ·本章小结 | 第29-30页 |
| 第三章 重构酿酒酵母胞质延胡索酸积累途径 | 第30-42页 |
| ·引言 | 第30-31页 |
| ·材料与方法 | 第31-34页 |
| ·菌株和质粒 | 第31页 |
| ·试剂和仪器 | 第31-32页 |
| ·培养基和培养条件 | 第32页 |
| ·RNA 提取及关键基因的克隆 | 第32页 |
| ·重组质粒的构建 | 第32-33页 |
| ·酿酒酵母转化 | 第33页 |
| ·酶活测定方法 | 第33-34页 |
| ·代谢物分析方法 | 第34页 |
| ·延胡索酸鉴定 | 第34页 |
| ·转录分析 | 第34页 |
| ·结果 | 第34-40页 |
| ·R. oryzae 关键基因的克隆 | 第34-35页 |
| ·重组质粒及工程菌株的构建 | 第35-36页 |
| ·苹果酸脱氢酶的过量表达对延胡索酸积累的影响 | 第36-37页 |
| ·延胡索酸的鉴定 | 第37-38页 |
| ·苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶的共表达 | 第38-39页 |
| ·酶活分析 | 第39页 |
| ·转录分析 | 第39页 |
| ·丙酮酸羧化酶的过量表达 | 第39-40页 |
| ·讨论 | 第40页 |
| ·丙酮酸羧化反应的作用分析 | 第40页 |
| ·乙醇的形成限制了延胡索酸的积累 | 第40页 |
| ·本章小结 | 第40-42页 |
| 第四章 基于 GSMM 分析改造线粒体氧化途径积累延胡索酸 | 第42-50页 |
| ·引言 | 第42-43页 |
| ·材料与方法 | 第43-45页 |
| ·菌株和质粒 | 第43页 |
| ·试剂和仪器 | 第43-44页 |
| ·培养基和培养条件 | 第44页 |
| ·文献研究方法 | 第44页 |
| ·In Silico 分析 | 第44页 |
| ·分析方法 | 第44页 |
| ·基因敲除及标记回收 | 第44-45页 |
| ·结果 | 第45-48页 |
| ·文献组学 | 第45页 |
| ·基于基因组规模代谢网络模型的候选基因敲除模拟 | 第45-46页 |
| ·基于生物学实验的 FUM1 基因敲除研究 | 第46-47页 |
| ·影响延胡索酸积累关键因素的探索 | 第47-48页 |
| ·讨论 | 第48页 |
| ·模型预测在代谢工程中的意义 | 第48页 |
| ·实验结果对模型完善和发展的意义 | 第48页 |
| ·本章小结 | 第48-50页 |
| 第五章 胞质还原途径与线粒体氧化途径协同积累延胡索酸 | 第50-58页 |
| ·引言 | 第50-51页 |
| ·材料与方法 | 第51-52页 |
| ·菌株和质粒 | 第51页 |
| ·试剂和仪器 | 第51页 |
| ·培养基与培养条件 | 第51页 |
| ·分子生物学操作 | 第51-52页 |
| ·代谢物分析方法 | 第52页 |
| ·结果 | 第52-55页 |
| ·RoMDH 的单独表达对延胡索酸积累的影响 | 第52页 |
| ·RoMDH 和 RoFUM1 同时过量表达对延胡索酸积累的影响 | 第52-53页 |
| ·TCA 中间代谢产物的添加对延胡索酸积累的影响 | 第53-54页 |
| ·苹果酸的添加对积累延胡索酸的影响 | 第54-55页 |
| ·讨论 | 第55-57页 |
| ·RoMDH 的过量表达对细胞氧化还原平衡的影响 | 第55-56页 |
| ·延胡索酸酶对延胡索酸积累的影响 | 第56页 |
| ·延胡索酸的积累需要大量的碳流流向苹果酸 | 第56-57页 |
| ·本章小结 | 第57-58页 |
| 第六章 强化丙酮酸羧化反应促进延胡索酸积累 | 第58-68页 |
| ·引言 | 第58页 |
| ·材料与方法 | 第58-60页 |
| ·菌株和质粒 | 第58-59页 |
| ·试剂和主要仪器 | 第59页 |
| ·培养基及培养条件 | 第59页 |
| ·RNA 提取及关键基因的克隆 | 第59页 |
| ·重组质粒的构建 | 第59-60页 |
| ·转化方法 | 第60页 |
| ·代谢物分析方法 | 第60页 |
| ·结果 | 第60-65页 |
| ·重组质粒及工程菌株的构建 | 第60-61页 |
| ·丙酮酸羧化酶的表达对延胡索酸积累的影响 | 第61-62页 |
| ·生物素的添加对工程菌株发酵特性的影响 | 第62-63页 |
| ·镁离子浓度对工程菌株发酵特性的影响 | 第63-64页 |
| ·碳氮比对工程菌株发酵特性的影响 | 第64-65页 |
| ·讨论 | 第65页 |
| ·丙酮酸羧化酶过量表达后碳流分析 | 第65页 |
| ·胞质延胡索酸酶对积累延胡索酸的作用分析 | 第65页 |
| ·本章小结 | 第65-68页 |
| 结论 | 第68-69页 |
| 论文创新点 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 附录Ⅰ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第77-78页 |
| 附录Ⅱ 米根霉关键基因序列 | 第78-84页 |
