| 致谢 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第19-25页 |
| 1.1 几丁质的简介 | 第19-20页 |
| 1.1.1 几丁质的结构性质 | 第19页 |
| 1.1.2 几丁质的功能与用途 | 第19-20页 |
| 1.2 几丁质酶的概述 | 第20-21页 |
| 1.2.1 几丁质酶的来源和分类 | 第20-21页 |
| 1.2.2 几丁质酶的特点与作用 | 第21页 |
| 1.3 微生物几丁质酶的概述 | 第21-23页 |
| 1.3.1 微生物几丁质酶的分布和分类 | 第21-22页 |
| 1.3.2 微生物的几丁质酶酶学性质 | 第22页 |
| 1.3.3 微生物几丁质酶的应用 | 第22-23页 |
| 1.3.3.1 几丁质酶水解产物的应用 | 第22页 |
| 1.3.3.2 几丁质酶在生物防治的应用 | 第22-23页 |
| 1.3.3.3 几丁质酶用于抗病的基因工程 | 第23页 |
| 1.3.3.4 调节生命代谢活动 | 第23页 |
| 1.4 本课题的研究意义 | 第23页 |
| 1.5 本课题研究内容与思路 | 第23-25页 |
| 第二章 短短芽孢杆菌几丁质酶的分离纯化及酶学性质 | 第25-37页 |
| 2.1 前言 | 第25页 |
| 2.2 实验材料和试剂 | 第25-27页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第25-26页 |
| 2.2.2 主要试剂和设备 | 第26-27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-29页 |
| 2.3.1 几丁质酶粗酶液的制备 | 第27页 |
| 2.3.2 几丁质酶的纯化 | 第27页 |
| 2.3.3 几丁质酶酶活力的测定 | 第27页 |
| 2.3.4 分子量的测定 | 第27-28页 |
| 2.3.5 最适pH值和酸碱稳定性的分析 | 第28页 |
| 2.3.6 最适温度和热稳定性的分析 | 第28页 |
| 2.3.7 部分金属离子对几丁质酶活性的影响 | 第28页 |
| 2.3.8 几丁质酶抗霉菌检测 | 第28-29页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第29-34页 |
| 2.4.1 几丁质酶的分离纯化 | 第29-30页 |
| 2.4.2 pH对几丁质酶酶活力的影响 | 第30-32页 |
| 2.4.3 温度对几丁质酶酶活力的影响 | 第32-33页 |
| 2.4.4 部分金属离子对几丁质酶酶活力的影响 | 第33页 |
| 2.4.5 几丁质酶抗霉菌检测 | 第33-34页 |
| 2.5 本章小结 | 第34-37页 |
| 第三章 短短芽孢杆菌几丁质酶发酵条件优化 | 第37-49页 |
| 3.1 引言 | 第37页 |
| 3.2 实验材料和试剂 | 第37-38页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第37页 |
| 3.2.2 主要试剂和设备 | 第37-38页 |
| 3.3 实验方法 | 第38-41页 |
| 3.3.1 酶活测定 | 第38-39页 |
| 3.3.2 不同碳源对酶活力的影响 | 第39页 |
| 3.3.3 不同氮源对酶活力的影响 | 第39页 |
| 3.3.4 培养基接种量对酶活力的影响 | 第39-40页 |
| 3.3.5 培养基初始pH值对酶活力的影响 | 第40页 |
| 3.3.6 培养基装样量对酶活力的影响 | 第40页 |
| 3.3.7 不同培养温度对酶活的影响 | 第40页 |
| 3.3.8 不同培养时间对酶活力的影响 | 第40-41页 |
| 3.3.9 摇床转速对酶活力的影响 | 第41页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第41-47页 |
| 3.4.1 不同碳源对酶活力的影响 | 第41-42页 |
| 3.4.2 不同氮源对酶活力的影响 | 第42-43页 |
| 3.4.3 培养基接种量对酶活力的影响 | 第43-44页 |
| 3.4.4 培养基初始pH值对酶活力的影响 | 第44页 |
| 3.4.5 培养基装样量对酶活力的影响 | 第44-45页 |
| 3.4.6 不同培养温度对酶活的影响 | 第45-46页 |
| 3.4.7 不同发酵时间对酶活力的影响 | 第46-47页 |
| 3.4.8 摇床转速对酶活力的影响 | 第47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-49页 |
| 第四章 短短芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及表达 | 第49-67页 |
| 4.1 引言 | 第49页 |
| 4.2 实验材料和试剂 | 第49-50页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第49页 |
| 4.2.2 主要试剂和设备 | 第49-50页 |
| 4.3 实验方法 | 第50-58页 |
| 4.3.1 目的基因克隆到T载体 | 第51-54页 |
| 4.3.1.1 基因组的提取 | 第51-53页 |
| 4.3.1.2 引物的设计 | 第53页 |
| 4.3.1.3 几丁质酶基因的PCR扩增 | 第53页 |
| 4.3.1.4 PR-3RACE连接、E.coliDH5α转化 | 第53-54页 |
| 4.3.1.5 蓝白斑筛选 | 第54页 |
| 4.3.1.6 测序 | 第54页 |
| 4.3.2 目的基因克隆到诱导型载体PET22b | 第54-58页 |
| 4.3.2.1 T载体(质粒)提取 | 第54-55页 |
| 4.3.2.2 设计酶切位点引物 | 第55页 |
| 4.3.2.3 目的基因PCR扩增 | 第55页 |
| 4.3.2.4 DNA胶回收和双酶切 | 第55-56页 |
| 4.3.2.5 pET-22b质粒的提取 | 第56页 |
| 4.3.2.6 pET-22b质粒酶切及回收 | 第56-57页 |
| 4.3.2.7 目的基因与pET-22b载体连接、转入E.coliDH5α感受态 | 第57页 |
| 4.3.2.8 阳性克隆的筛选及验证 | 第57页 |
| 4.3.2.9 表达菌株的构建及其表达检测 | 第57-58页 |
| 4.3.2.10 酶活力的测定 | 第58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-66页 |
| 4.4.1 目的基因克隆到T载体 | 第58-61页 |
| 4.4.1.1 目的基因PCR扩增基因 | 第58-59页 |
| 4.4.1.2 PR-3RACE连接,转化E·coliDH5α中,菌液PCR | 第59-60页 |
| 4.4.1.3 测序结果 | 第60-61页 |
| 4.4.2 目的基因克隆到pET-22b载体 | 第61-66页 |
| 4.4.2.1 带有酶切位点的目的基因PCR扩增 | 第61-62页 |
| 4.4.2.2 DNA胶回收 | 第62页 |
| 4.4.2.3 pET-22b质粒的提取 | 第62-63页 |
| 4.4.2.4 酶切后的目的基因和pET-22b质粒 | 第63页 |
| 4.4.2.5 连接,转化E·coliDH5α中,菌液PCR产物 | 第63-64页 |
| 4.4.2.6 提取质粒进行酶切验证 | 第64-66页 |
| 4.4.2.7 提取pET-22b质粒转化到E.ColiBL21(DE_3)中 | 第66页 |
| 4.4.2.8 重组基因的表达检测 | 第66页 |
| 4.5 本章小结 | 第66-67页 |
| 第五章 重组酶的酶学性质及发酵条件的研究 | 第67-85页 |
| 5.1 引言 | 第67页 |
| 5.2 实验材料和试剂 | 第67-69页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第67-68页 |
| 5.2.2 主要试剂和设备 | 第68-69页 |
| 5.3 实验方法 | 第69-73页 |
| 5.3.1 重组酶的酶学性质 | 第69-71页 |
| 5.3.1.1 最适温度与温度耐受性 | 第69页 |
| 5.3.1.2 最适pH与pH耐受性 | 第69-70页 |
| 5.3.1.3 化合物对酶活的影响 | 第70页 |
| 5.3.1.4 底物特异性 | 第70页 |
| 5.3.1.5 动力学常数Km及Vmax的测定 | 第70页 |
| 5.3.1.6 目标蛋白的获得 | 第70页 |
| 5.3.1.7 SDS-PAGE测定蛋白质分子量 | 第70-71页 |
| 5.3.2 重组酶诱导条件的优化 | 第71-73页 |
| 5.3.2.1 发酵液接种量对重组酶活力的影响 | 第71页 |
| 5.3.2.2 发酵液装样量对重组酶活力的影响 | 第71页 |
| 5.3.2.3 诱导时间对重组酶活力的影响 | 第71页 |
| 5.3.2.4 诱导浓度对重组酶活力的影响 | 第71-72页 |
| 5.3.2.5 诱导时菌浓对重组酶活力的影响 | 第72页 |
| 5.3.2.6 诱导温度对重组酶活力的影响 | 第72页 |
| 5.3.2.7 诱导转速对重组酶活力的影响 | 第72-73页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第73-82页 |
| 5.4.1 重组酶的酶学性质 | 第73-78页 |
| 5.4.1.1 重组酶的最适反应温度(A)与重组酶的温度耐受性(B) | 第73-74页 |
| 5.4.1.2 重组酶的最适反应pH(A)与重组酶的pH耐受性(B) | 第74-75页 |
| 5.4.1.3 化合物对酶活的影响 | 第75-76页 |
| 5.4.1.4 底物特异性 | 第76页 |
| 5.4.1.5 动力学常数Km及Vmax的测定 | 第76-77页 |
| 5.4.1.6 重组酶的分离纯化 | 第77-78页 |
| 5.4.2 重组酶诱导条件的优化 | 第78-82页 |
| 5.4.2.1 50ml发酵液接种量对重组酶活力的影响 | 第78-79页 |
| 5.4.2.2 发酵液装样量对重组酶活力的影响 | 第79页 |
| 5.4.2.3 IPTG诱导时间对重组酶活力的影响 | 第79-80页 |
| 5.4.2.4 IPTG诱导浓度对重组酶活力的影响 | 第80页 |
| 5.4.2.5 诱导时菌浓对重组酶活力的影响 | 第80-81页 |
| 5.4.2.6 诱导温度对重组酶活力的影响 | 第81-82页 |
| 5.4.2.7 诱导转速对重组酶活力的影响 | 第82页 |
| 5.5 本章小结 | 第82-85页 |
| 第六章 结论与展望 | 第85-87页 |
| 6.1 结论 | 第85-86页 |
| 6.2 展望 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-91页 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 | 第91页 |
