| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 概述 | 第11-12页 |
| 1.2 国内外研究进展 | 第12-18页 |
| 1.2.1 过量积累 α-KG菌株的发现与筛选 | 第12-14页 |
| 1.2.2 硫胺素不足引起菌株过量积累 α-KG | 第14页 |
| 1.2.3 环境中的碳氮比对 α-KG积累的影响 | 第14-15页 |
| 1.2.4 过量积累 α-KG菌株细胞内代谢特点 | 第15-16页 |
| 1.2.5 微生物产 α-KG的发酵过程优化与控制 | 第16-17页 |
| 1.2.6 生产菌株代谢工程改造 | 第17-18页 |
| 1.3 本论文主要研究内容 | 第18-21页 |
| 1.3.1 利用微生物生产 α-KG主要面临的问题 | 第18-20页 |
| 1.3.2 本文主要研究内容 | 第20-21页 |
| 第二章Y. lipolytica WSH-Z06 全基因组测序及产酸机制 | 第21-29页 |
| 2.1 前言 | 第21-22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-23页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第22页 |
| 2.2.3 基因组提取 | 第22页 |
| 2.2.4 Illumina MiSeq平台测序 | 第22页 |
| 2.2.5 PacBio RS平台测序 | 第22页 |
| 2.2.6 基因组序列组装 | 第22-23页 |
| 2.2.7 基因预测与注释 | 第23页 |
| 2.2.8 比较基因组学分析 | 第23页 |
| 2.3 结果 | 第23-28页 |
| 2.3.1 Y. lipolytica WSH-Z06 全基因组测序 | 第23页 |
| 2.3.2 基因组组装 | 第23-24页 |
| 2.3.3 基因结构预测与注释 | 第24-25页 |
| 2.3.4 Y. lipolytica WSH-Z06 与Y. lipolytica CLIB122 比较基因组学分析 | 第25-28页 |
| 2.4 本章小结 | 第28-29页 |
| 第三章 羧酸转运蛋白鉴定与强化 α-KG的跨膜转运 | 第29-49页 |
| 3.1 前言 | 第29-30页 |
| 3.2 材料与方法 | 第30-37页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第30-31页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第31-32页 |
| 3.2.3 培养基 | 第32页 |
| 3.2.4 分子操作 | 第32-34页 |
| 3.2.5 培养条件 | 第34页 |
| 3.2.6 转运蛋白筛选及跨膜结构预测 | 第34页 |
| 3.2.7 酮酸处理 | 第34-35页 |
| 3.2.8 S. cerevisiae JEN1 与ADY2 的敲除及酮酸转运蛋白的异源表达 | 第35-36页 |
| 3.2.9 Y. lipolytica中过量表达转运蛋白基因及基因拷贝数测定 | 第36-37页 |
| 3.2.10 甘油和有机酸的测定 | 第37页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第37-46页 |
| 3.3.1 Y. lipolytica WSH-Z06 全基因组范围酮酸转运蛋白预测与筛选 | 第37-41页 |
| 3.3.2 培养基中高浓度酮酸处理 | 第41-42页 |
| 3.3.3 酮酸转运蛋白功能鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.4 酮酸转运蛋白底物特异性测定 | 第43-44页 |
| 3.3.5 酮酸转运蛋白在Y. lipolytica WSH-Z06 中表达 | 第44-45页 |
| 3.3.6 强化Y. lipolytica发酵生产酮酸过程中酮酸转运 | 第45-46页 |
| 3.4 本章小结 | 第46-49页 |
| 第四章 环境低pH促进Y. lipolytica合成 α-KG蛋白调控机制 | 第49-65页 |
| 4.1 前言 | 第49-50页 |
| 4.2 材料与方法 | 第50-54页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第50页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第50-51页 |
| 4.2.3 培养基 | 第51页 |
| 4.2.4 双向电泳 | 第51-52页 |
| 4.2.5 差异蛋白质谱鉴定 | 第52页 |
| 4.2.6 酵母总RNA提取及反转录定量PCR | 第52-54页 |
| 4.2.7 培养条件 | 第54页 |
| 4.2.8 甘油和有机酸的测定 | 第54页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第54-63页 |
| 4.3.1 环境低pH刺激促进Y. lipolytica WSH-Z06 合成 α-KG | 第54-56页 |
| 4.3.2 环境低pH刺激改变总细胞蛋白表达 | 第56-58页 |
| 4.3.3 环境低pH刺激改变线粒体蛋白表达 | 第58-60页 |
| 4.3.4 差异表达蛋白分析 | 第60-61页 |
| 4.3.5 环境低pH刺激促进 α-KG合成 | 第61-63页 |
| 4.4 本章小结 | 第63-65页 |
| 第五章 强化前体乙酰-CoA供给促进 α-KG合成 | 第65-79页 |
| 5.1 前言 | 第65-66页 |
| 5.2 材料与方法 | 第66-69页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第66页 |
| 5.2.2 试剂和仪器 | 第66-67页 |
| 5.2.3 培养基 | 第67页 |
| 5.2.4 分子操作 | 第67-68页 |
| 5.2.5 培养条件 | 第68页 |
| 5.2.6 Y. lipolytica中基因表达及验证 | 第68-69页 |
| 5.2.7 PDHC总催化活力、E1、E2 和E3 组分催化活力测定 | 第69页 |
| 5.2.8 细胞内乙酰-CoA含量测定 | 第69页 |
| 5.2.9 甘油和有机酸的测定 | 第69页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第69-76页 |
| 5.3.1 过量表达PDHC组分影响菌株生长和细胞内乙酰-CoA供应 | 第69-71页 |
| 5.3.2 过量表达PDHC组分影响菌株PDHC催化活性 | 第71-72页 |
| 5.3.3 过量表达PDHC组分影响硫胺素对酮酸积累 | 第72-74页 |
| 5.3.4 过量表达PDHC组分影响碳代谢通量并促进 α-KG合成 | 第74-76页 |
| 5.4 本章小结 | 第76-79页 |
| 第六章 调控酮戊二酸脱氢酶活性促进 α-KG积累 | 第79-93页 |
| 6.1 前言 | 第79-80页 |
| 6.2 材料与方法 | 第80-83页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第80页 |
| 6.2.2 试剂和仪器 | 第80页 |
| 6.2.3 培养基 | 第80-81页 |
| 6.2.4 分子操作 | 第81页 |
| 6.2.5 培养条件 | 第81页 |
| 6.2.6 Y. lipolytica中基因表达及定点突变 | 第81-82页 |
| 6.2.7 蛋白纯化及SDS-PAGE检测 | 第82页 |
| 6.2.8 KGDH总催化活力及酶动力学参数测定 | 第82-83页 |
| 6.2.9 甘油和有机酸的测定 | 第83页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第83-91页 |
| 6.3.1 DLST保守活性位点残基鉴定及突变 | 第83-85页 |
| 6.3.2 活性位点残基突变对重组菌株生长的影响 | 第85-86页 |
| 6.3.3 活性位点残基突变对重组生长KDGH活性影响 | 第86-88页 |
| 6.3.4 活性位点残基突变影响DLST催化效率 | 第88-89页 |
| 6.3.5 活性位点残基突变强化突变菌株 α-KG积累 | 第89-91页 |
| 6.4 本章小结 | 第91-93页 |
| 主要结论与展望 | 第93-95页 |
| 主要结论 | 第93页 |
| 展望 | 第93-95页 |
| 论文创新点 | 第95-97页 |
| 致谢 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-109页 |
| 附录：作者在攻读博士期间发表的论文 | 第109页 |
