| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-42页 |
| ·β-半乳糖苷酶简介 | 第12-18页 |
| ·糖苷水解酶家族简介 | 第12-14页 |
| ·β-半乳糖苷酶研究概况 | 第14-16页 |
| ·耐热β-半乳糖苷酶的特点及应用价值 | 第16-18页 |
| ·(β/α)_8-桶状结构酶分子进化研究进展 | 第18-21页 |
| ·折叠及折叠单元 | 第18-19页 |
| ·催化活性 | 第19-20页 |
| ·热稳定性 | 第20页 |
| ·底物特异性和立体选择性 | 第20-21页 |
| ·蛋白质工程简介 | 第21-30页 |
| ·蛋白质的理性设计 | 第22-24页 |
| ·定向进化-以理性为基础的非理性设计 | 第24-28页 |
| ·蛋白质的半理性设计 | 第28-30页 |
| ·β-半乳糖苷酶在乳糖水解中存在的问题 | 第30-31页 |
| ·立题依据与研究内容 | 第31-32页 |
| 参考文献 | 第32-42页 |
| 第二章 β-半乳糖苷酶BgaB 结构模拟及底物抑制作用改造 | 第42-60页 |
| ·引言 | 第42页 |
| ·实验材料 | 第42-43页 |
| ·菌株和质粒 | 第42页 |
| ·生化试剂 | 第42-43页 |
| ·培养基 | 第43页 |
| ·主要实验仪器 | 第43页 |
| ·实验方法 | 第43-47页 |
| ·同源序列比对 | 第43页 |
| ·底物复合模型构建及质量评估 | 第43页 |
| ·分子动力学模拟 | 第43-44页 |
| ·模型质量评估及底物对接 | 第44页 |
| ·定点突变体的构建 | 第44-45页 |
| ·野生型及突变酶的表达及粗酶制备 | 第45页 |
| ·野生型及突变酶的Ni-NTA 纯化 | 第45页 |
| ·SDS-PAGE 蛋白质凝胶电泳 | 第45-46页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性测定 | 第46页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第46页 |
| ·最适反应pH 及pH 稳定性测定 | 第46-47页 |
| ·乳糖水解率计算 | 第47页 |
| ·动力学常数测定 | 第47页 |
| ·结合能计算 | 第47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-57页 |
| ·β-半乳糖苷酶BgaB 分子结构分析 | 第47-51页 |
| ·参与底物结合关键氨基酸位点分析 | 第51-53页 |
| ·预测氨基酸位点对底物结合作用的鉴定分析 | 第53-55页 |
| ·氨基酸位点催化作用分析 | 第55页 |
| ·Phe341 位点对底物抑制作用改造 | 第55-57页 |
| ·小结 | 第57页 |
| 参考文献 | 第57-60页 |
| 第三章 半理性设计改造耐热β-半乳糖苷酶水解活性 | 第60-78页 |
| ·引言 | 第60页 |
| ·实验材料 | 第60-61页 |
| ·菌株和质粒 | 第60页 |
| ·生化试剂 | 第60页 |
| ·培养基 | 第60-61页 |
| ·主要实验仪器 | 第61页 |
| ·实验方法 | 第61-65页 |
| ·表达系统构建及产物分析 | 第61-62页 |
| ·点饱和突变库的构建 | 第62-64页 |
| ·饱和突变库的筛选 | 第64-65页 |
| ·野生型及突变酶的表达和纯化 | 第65页 |
| ·Western blot | 第65页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性测定 | 第65页 |
| ·最适反应pH 及pH 稳定性测定 | 第65页 |
| ·动力学常数测定 | 第65页 |
| ·结果与讨论 | 第65-75页 |
| ·表达系统的选择与比较 | 第65-67页 |
| ·筛选方法的建立及灵敏性分析 | 第67-68页 |
| ·突变位点的半理性设计及筛选结果 | 第68-69页 |
| ·突变体的纯化与活性分析 | 第69-70页 |
| ·最适pH 的变化 | 第70-71页 |
| ·突变体的性质鉴定 | 第71-74页 |
| ·Arg109 位点对水解活性的影响 | 第74-75页 |
| ·小结 | 第75页 |
| 参考文献 | 第75-78页 |
| 第四章 非催化域位点Ile42 对热稳定性的影响 | 第78-92页 |
| ·引言 | 第78页 |
| ·材料与方法 | 第78-82页 |
| ·菌株和质粒 | 第78页 |
| ·生化试剂 | 第78页 |
| ·主要实验仪器 | 第78页 |
| ·多重序列比对及氢键分析 | 第78页 |
| ·定点突变方法 | 第78-80页 |
| ·96 孔板热稳定性分析体系建立 | 第80-81页 |
| ·野生型及突变酶的表达及纯化 | 第81页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性测定 | 第81页 |
| ·β-半乳糖苷酶热稳定性测定 | 第81页 |
| ·差式扫描量热(DSC)测定酶变性温度 | 第81-82页 |
| ·结果与讨论 | 第82-88页 |
| ·突变设计思路的确立及位点选择 | 第82-83页 |
| ·突变体热稳定性比较 | 第83-84页 |
| ·Ile42 位点对热稳定性影响的探讨 | 第84-86页 |
| ·氢键对热稳定的影响 | 第86-88页 |
| ·小结 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-92页 |
| 第五章 耐热β-半乳糖苷酶累积突变及突变体性质研究 | 第92-110页 |
| ·引言 | 第92页 |
| ·材料与方法 | 第92页 |
| ·菌株和质粒 | 第92页 |
| ·主要试剂及仪器设备 | 第92页 |
| ·野生型及突变酶的表达及纯化 | 第92页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性测定 | 第92页 |
| ·最适反应pH | 第92页 |
| ·β-半乳糖苷酶热稳定性测定 | 第92页 |
| ·动力学常数测定 | 第92页 |
| ·结果 | 第92-107页 |
| ·累积突变设计及活性分析 | 第92-95页 |
| ·影响水解活性位点间的累积作用 | 第95-99页 |
| ·影响底物抑制与水解活性位点间的累积作用 | 第99-102页 |
| ·影响热稳定性与水解活性位点间的累积作用 | 第102-105页 |
| ·影响热稳定性与底物抑制位点间的累积作用 | 第105-107页 |
| ·讨论 | 第107-108页 |
| ·小结 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-110页 |
| 主要结论与展望 | 第110-112页 |
| 论文主要创新点 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第114-115页 |
| 附录 | 第115页 |