| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第18-19页 |
| 第一章 引言 | 第19-40页 |
| 1.1 耐热性脂肪酶对UHT乳的影响 | 第19页 |
| 1.2 牛乳中脂肪酶酶活检测方法研究进展 | 第19-23页 |
| 1.2.1 滴定法 | 第19-20页 |
| 1.2.2 比色法 | 第20-21页 |
| 1.2.3 荧光法 | 第21页 |
| 1.2.4 其他方法 | 第21-23页 |
| 1.3 微生物脂肪酶概述 | 第23-30页 |
| 1.3.1 脂肪酶简介 | 第23-24页 |
| 1.3.2 微生物脂肪酶的分类 | 第24-26页 |
| 1.3.3 微生物脂肪酶的结构 | 第26-29页 |
| 1.3.3.1 微生物脂肪酶一级结构 | 第26-27页 |
| 1.3.3.2 微生物脂肪酶二级结构 | 第27-28页 |
| 1.3.3.3 微生物脂肪酶三级结构 | 第28-29页 |
| 1.3.4 微生物脂肪酶的应用 | 第29-30页 |
| 1.3.4.1 食品工业上的应用 | 第29-30页 |
| 1.3.4.2 洗涤剂上的应用 | 第30页 |
| 1.3.4.3 在其他工业上的应用 | 第30页 |
| 1.4 牛乳中耐热性脂肪酶来源 | 第30-31页 |
| 1.5 嗜冷菌 | 第31-32页 |
| 1.5.1 嗜冷菌定义 | 第31页 |
| 1.5.2 优势嗜冷菌 | 第31-32页 |
| 1.6 大肠杆菌表达系统 | 第32-33页 |
| 1.6.1 大肠杆菌表达系统的特点 | 第32-33页 |
| 1.6.2 大肠杆菌表达载体 | 第33页 |
| 1.6.3 大肠杆菌表达宿主菌 | 第33页 |
| 1.7 提高大肠杆菌可溶性表达的方法 | 第33-34页 |
| 1.8 信号肽融合分泌表达 | 第34-37页 |
| 1.8.1 Ⅰ型分泌途径 | 第34-35页 |
| 1.8.2 Ⅱ型分泌途径 | 第35-37页 |
| 1.8.2.1 细胞质膜转运 | 第36-37页 |
| 1.8.2.2 周质蛋白转运到胞外 | 第37页 |
| 1.9 本课题的研究目的和意义 | 第37-40页 |
| 1.9.1 研究意义 | 第37-38页 |
| 1.9.2 研究内容 | 第38页 |
| 1.9.3 研究目标 | 第38-39页 |
| 1.9.4 拟解决的关键科学技术问题 | 第39-40页 |
| 第二章 高通量检测原料乳及液态奶制品脂肪酶活性方法研究 | 第40-53页 |
| 2.1 前言 | 第40-41页 |
| 2.2 材料与方法 | 第41-44页 |
| 2.2.1 材料 | 第41页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第41页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第41页 |
| 2.2.4 试验方法 | 第41-44页 |
| 2.2.4.1 溶液配制 | 第41页 |
| 2.2.4.2 原料乳的不同热处理 | 第41-42页 |
| 2.2.4.3 澄清缓冲液处理不同液态奶 | 第42页 |
| 2.2.4.4 不同脂肪酶酶活的UHT乳脂肪酶检测 | 第42页 |
| 2.2.4.5 标准曲线的制作 | 第42-43页 |
| 2.2.4.6 应用参考方法测量不同脂肪酶酶活的UHT乳 | 第43页 |
| 2.2.4.7 不同热处理原料乳脂肪酶酶活检测 | 第43页 |
| 2.2.4.8 实验方法灵敏度验证 | 第43页 |
| 2.2.4.9 实验结果精密度与准确度 | 第43-44页 |
| 2.3 结果和讨论 | 第44-52页 |
| 2.3.1 澄清缓冲液对不同牛乳澄清效果 | 第44-45页 |
| 2.3.2 浊度对脂肪酶酶活检测的影响 | 第45-46页 |
| 2.3.3 标准曲线 | 第46-47页 |
| 2.3.4 检测方法的灵敏度和线性 | 第47-48页 |
| 2.3.5 检测方法的精密度和准确度 | 第48-49页 |
| 2.3.6 参考方法的标准曲线制作 | 第49页 |
| 2.3.7 与参考方法对比 | 第49-51页 |
| 2.3.8 新方法实际应用 | 第51-52页 |
| 2.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 第三章 荧光假单胞菌脂肪酶的克隆与表达 | 第53-72页 |
| 3.1 引言 | 第53页 |
| 3.2 材料与方法 | 第53-65页 |
| 3.2.1 主要试剂 | 第53-54页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第54-55页 |
| 3.2.3 实验菌株 | 第55页 |
| 3.2.4 培养基和溶液配制 | 第55-56页 |
| 3.2.5 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第56-57页 |
| 3.2.6 荧光假单胞菌BJ-10全基因组DNA提取 | 第57-58页 |
| 3.2.6.1 菌株的复苏及扩大培养 | 第57页 |
| 3.2.6.2 全基因组DNA提取 | 第57-58页 |
| 3.2.7 lipBJ10基因扩增 | 第58-59页 |
| 3.2.7.1 引物设计 | 第58页 |
| 3.2.7.2 PCR扩增lipBJ | 第58-59页 |
| 3.2.7.3 DNA片段测序 | 第59页 |
| 3.2.8 lipBJ10全长基因扩增 | 第59-61页 |
| 3.2.8.1 lipBJ10编码序列查找 | 第59页 |
| 3.2.8.2 引物设计 | 第59-60页 |
| 3.2.8.3 PCR扩增lipBJ10全基因片段 | 第60-61页 |
| 3.2.9 pET-22b(+)克隆菌株构建 | 第61-62页 |
| 3.2.9.1 pET-22b(+)转入克隆菌株BL21DH5α | 第61页 |
| 3.2.9.2 单克隆菌株的筛选和鉴定 | 第61-62页 |
| 3.2.10 重组表达载体的克隆菌株构建 | 第62-63页 |
| 3.2.10.1 表达载体的构建 | 第62页 |
| 3.2.10.2 连接载体转入克隆菌株BL21DH5α | 第62页 |
| 3.2.10.3 单克隆菌株的筛选和鉴定 | 第62-63页 |
| 3.2.11 表达工程菌株的构建和筛选 | 第63页 |
| 3.2.11.1 将重组表达质粒转入表达菌株BL21(DE3) | 第63页 |
| 3.2.11.2 单克隆菌株的筛选和鉴定 | 第63页 |
| 3.2.12 lipBJ10的表达 | 第63-64页 |
| 3.2.12.1 种子液制备 | 第63页 |
| 3.2.12.2 发酵条件优化 | 第63-64页 |
| 3.2.12.3 最适条件发酵表达 | 第64页 |
| 3.2.13 不同细胞组份的分离 | 第64页 |
| 3.2.14 BCA蛋白质定量分析 | 第64页 |
| 3.2.15 SDS-PAGE分析各组份 | 第64-65页 |
| 3.2.16 脂肪酶酶活检测 | 第65页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第65-70页 |
| 3.3.1 lipBJ10的扩增 | 第65页 |
| 3.3.2 lipBJ10编码序列 | 第65-66页 |
| 3.3.3 lipBJ10全长PCR扩增 | 第66页 |
| 3.3.4 lipBJ10序列 | 第66页 |
| 3.3.5 重组质粒的构建 | 第66-67页 |
| 3.3.6 pET-SigPFL00质粒的双酶切验证 | 第67-68页 |
| 3.3.7 重组质粒的转化和鉴定 | 第68页 |
| 3.3.8 最适发酵条件 | 第68-69页 |
| 3.3.8.1 SDS-PAGE分析 | 第68-69页 |
| 3.3.8.2 脂肪酶活分析 | 第69页 |
| 3.3.9 不同细胞组分SDS-PAGE分析 | 第69-70页 |
| 3.4 本章小结 | 第70-72页 |
| 第四章 荧光假单胞菌脂肪酶周质表达系统的建立 | 第72-91页 |
| 4.1 前言 | 第72页 |
| 4.2 材料和方法 | 第72-81页 |
| 4.2.1 主要试验试剂 | 第72-73页 |
| 4.2.2 主要试验仪器与设备 | 第73页 |
| 4.2.3 实验用菌株和质粒 | 第73-74页 |
| 4.2.4 培养基和溶液 | 第74页 |
| 4.2.5 信号肽筛选 | 第74-75页 |
| 4.2.6 信号肽与lipBJ10连接方式 | 第75页 |
| 4.2.7 信号肽序列合成 | 第75-76页 |
| 4.2.8 引物设计 | 第76页 |
| 4.2.9 周质表达载体构建 | 第76-78页 |
| 4.2.9.1 信号肽的处理 | 第76-77页 |
| 4.2.9.2 PCR扩增lipBJ | 第77-78页 |
| 4.2.9.3 双酶切pET-22b(+) | 第78页 |
| 4.2.10 周质表达载体克隆菌株的构建 | 第78页 |
| 4.2.11 周质表达载体的表达菌株构建 | 第78页 |
| 4.2.12 lipBJ10周质表达 | 第78-79页 |
| 4.2.13 不同浓度IPTG诱导 | 第79页 |
| 4.2.14 透射电镜 | 第79-80页 |
| 4.2.15 细胞不同组分提取 | 第80页 |
| 4.2.15.1 全细胞破碎上清液 | 第80页 |
| 4.2.15.2 周质蛋白提取 | 第80页 |
| 4.2.15.3 细胞质蛋白提取 | 第80页 |
| 4.2.15.4 包涵体提取 | 第80页 |
| 4.2.16 BCA蛋白定量分析 | 第80-81页 |
| 4.2.17 SDS-PAGE分析不同细胞组分 | 第81页 |
| 4.2.18 脂肪酶活检测 | 第81页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第81-90页 |
| 4.3.1 周质表达载体以及菌株的构建 | 第81-82页 |
| 4.3.2 周质表达菌株的构建 | 第82页 |
| 4.3.3 周质蛋白定位 | 第82-84页 |
| 4.3.4 IPTG浓度以及信号肽对蛋白表达的影响 | 第84-86页 |
| 4.3.5 电镜图分析 | 第86-87页 |
| 4.3.6 信号肽对脂肪酶活的影响 | 第87页 |
| 4.3.7 不同组份脂肪酶活性 | 第87-88页 |
| 4.3.8 周质表达lipBJ10的最适信号肽 | 第88-90页 |
| 4.4 本章小结 | 第90-91页 |
| 第五章 周质表达条件优化 | 第91-106页 |
| 5.1 前言 | 第91-92页 |
| 5.2 材料和方法 | 第92-95页 |
| 5.2.1 实验菌株 | 第92页 |
| 5.2.2 主要试验试剂 | 第92-93页 |
| 5.2.3 主要试验仪器与设备 | 第93页 |
| 5.2.4 培养基和溶液 | 第93页 |
| 5.2.5 周质组分的提取 | 第93页 |
| 5.2.6 脂肪酶活检测 | 第93页 |
| 5.2.7 单因素实验设计 | 第93-94页 |
| 5.2.7.1 温度和IPTG | 第93-94页 |
| 5.2.7.2 发酵时间 | 第94页 |
| 5.2.8 最陡爬坡试验设计 | 第94页 |
| 5.2.9 中心组合实验设计 | 第94页 |
| 5.2.10 验证试验 | 第94-95页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第95-104页 |
| 5.3.1 单因素优化实验结果 | 第95-98页 |
| 5.3.1.1 温度、IPTG浓度对周质脂肪酶活的影响 | 第95-96页 |
| 5.3.1.2 最适温度条件下IPTG的影响 | 第96页 |
| 5.3.1.3 最适IPTG浓度条件下温度的影响 | 第96-97页 |
| 5.3.1.4 发酵时间对周质脂肪酶活的影响 | 第97-98页 |
| 5.3.2 最陡爬坡试验结果 | 第98页 |
| 5.3.3 中心组合试验和响应面分析 | 第98-100页 |
| 5.3.4 模型诊断 | 第100-101页 |
| 5.3.5 响应面交互作用分析与优化 | 第101-104页 |
| 5.3.5.1 温度与IPTG诱导浓度响应面模型图 | 第101-102页 |
| 5.3.5.2 温度与诱导时间响应面模型图 | 第102-103页 |
| 5.3.5.3 IPTG诱导浓度与诱导时间响应面模型图 | 第103-104页 |
| 5.3.6 验证试验 | 第104页 |
| 5.4 小结 | 第104-106页 |
| 第六章 LIPBJ10的分离纯化及其酶学特性研究 | 第106-126页 |
| 6.1 前言 | 第106页 |
| 6.2 材料与方法 | 第106-114页 |
| 6.2.1 实验菌株 | 第106页 |
| 6.2.2 主要试验试剂 | 第106-107页 |
| 6.2.3 主要试验仪器与设备 | 第107页 |
| 6.2.4 培养基和溶液配制 | 第107-109页 |
| 6.2.5 lipBJ10周质表达 | 第109页 |
| 6.2.6 周质蛋白质提取 | 第109页 |
| 6.2.7 脂肪酶活检测 | 第109-110页 |
| 6.2.7.1 乳化法 | 第109-110页 |
| 6.2.7.2 分光光度法 | 第110页 |
| 6.2.8 Ni-NTA亲和层析 | 第110页 |
| 6.2.8.1 样品前处理 | 第110页 |
| 6.2.8.2 样品纯化步骤 | 第110页 |
| 6.2.9 尺寸排阻色谱凝胶层析 | 第110-111页 |
| 6.2.9.1 Ni-NTA纯化后的样品处理 | 第111页 |
| 6.2.9.2 lipBJ10样品分离纯化 | 第111页 |
| 6.2.10 BCA蛋白质定量分析 | 第111页 |
| 6.2.11 SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第111页 |
| 6.2.12 pH对lipBJ10的影响 | 第111-112页 |
| 6.2.12.1 不同pH对对硝基苯酚吸光值的影响 | 第111页 |
| 6.2.12.2 不同pH值条件下lipBJ10酶活 | 第111-112页 |
| 6.2.12.3 不同pH值下lipBJ10的稳定性 | 第112页 |
| 6.2.13 温度对lipBJ10的影响 | 第112-113页 |
| 6.2.13.1 不同温度下lipBJ10酶活 | 第112页 |
| 6.2.13.2 高温下lipBJ10稳定性 | 第112-113页 |
| 6.2.14 金属离子对lipBJ10的影响 | 第113页 |
| 6.2.15 表面活性剂和还原剂对lipBJ10的影响 | 第113页 |
| 6.2.16 有机试剂对lipBJ10的影响 | 第113页 |
| 6.2.17 动力学常数测定 | 第113-114页 |
| 6.2.18 质谱分析 | 第114页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第114-124页 |
| 6.3.1 Ni-NTA亲和层析 | 第114-115页 |
| 6.3.2 尺寸排阻色谱—凝胶层析 | 第115-116页 |
| 6.3.3 SDS-PAGE分析lipBJ10纯化效果 | 第116-117页 |
| 6.3.4 不同pH值下对硝基苯酚吸光值 | 第117-118页 |
| 6.3.5 最适pH值及其稳定性 | 第118-119页 |
| 6.3.6 最适温度及其热稳定性 | 第119-120页 |
| 6.3.7 金属离子对lipBJ10的影响 | 第120-121页 |
| 6.3.8 表面活性剂和还原剂对lipBJ10的影响 | 第121-122页 |
| 6.3.9 有机试剂对lipBJ10的影响 | 第122-123页 |
| 6.3.10 动力学常数分析 | 第123页 |
| 6.3.11 质谱分析结果 | 第123-124页 |
| 6.4 本章小结 | 第124-126页 |
| 第七章 主要结论 | 第126-131页 |
| 7.1 高通量检测原料乳及其乳制品脂肪酶酶活性方法研究 | 第126页 |
| 7.2 荧光假单胞菌脂肪酶的克隆与表达 | 第126-127页 |
| 7.3 荧光假单胞菌脂肪酶的高效表达系统的建立 | 第127-128页 |
| 7.4 周质表达条件优化 | 第128页 |
| 7.5 LIPBJ10的分离纯化及其酶学特性研究 | 第128-129页 |
| 7.6 本文的创新点 | 第129页 |
| 7.7 研究展望 | 第129-131页 |
| 参考文献 | 第131-143页 |
| 附录一 | 第143-146页 |
| 致谢 | 第146-147页 |
| 作者简历 | 第147页 |
